甘草素调节LKB1_AMPK信号通路对冠心病大鼠的心脏保护作用研究.pdf
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1、916基础与实验研究四川医学2 0 2 3年9 月第44卷(第9 期)Sichuan Medical Journal,2023,Vol.44,No.9doi:10.16252/ki.issn1004-0501-2023.09.004论著甘草素调节LKB1/AMPK信号通路对冠心病大鼠的心脏保护作用研究练强(成都市第三人民医院,四川成都6 10 0 0 0)【摘要】目的探讨甘草素(Lig)调节肝激酶B1(LKB1)/腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)信号通路对冠心病大鼠的心脏保护作用。方法Wistar大鼠随机分为对照组及造模组,造模组通过高脂饲料喂养以及腹腔注射垂体后叶素建立冠心病大鼠模型,将造模成
2、功的冠心病大鼠随机分为冠心病组、Liq 低剂量(Liq-L)组(10 0 mg/kg Liq)、Li g 高剂量(Liq-H)组(30 0 mg/kgLig)、Li q-H+Ra d i c i c o l 组(30 0 mg/kg Liq+40mg/kg Radicicol)。干预结束后,检测心功能左心室收缩末期直径(LVSD)、射血分数(EF)、左心室舒张末期直径(LVDD)和左心室缩短分数(FS)及血脂水平总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL);ELI SA 检测血清中炎性因子白细胞介素(IL)-1、I L-6、肿瘤坏死因子(TNF)-及氧化应
3、激因子谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平;分离心脏组织,HE染色观察组织病理变化;WesternBlot检测p-AMPK/AMPK、LK B1表达水平。结果与对照组相比,冠心病组大鼠心脏组织排列紊乱,有大量炎性细胞浸润,大鼠IL-1、IL-6、T NF-水平、TC、T G、LD L、LVSD、LVD D、M D A 显著增加,P-AMPK/AMPK、LK B1表达、HDL、EF、FS、SO D、CSH 显著降低(P0.05);与冠心病组相比,Liq-L组、Liq-H组病理损伤得到缓解,IL-1、IL-6、T NF-水平、TC、T G、LD L、LVSD、LVD
4、D、M D A 显著降低,p-AMPK/AMPK、LK B1表达、HDL、EF、FS、SO D、CSH显著增加(P0.05);与Liq-H组相比,Liq-H+Radicicol 组病理损伤加重,IL-1、IL-6、T NF-水平、TC、T C、LD L、LVSD、LVD D、M D A 显著增加,P-AMPK/AMPK、LK B1表达、HDL、EF、FS、SO D、G SH 显著降低(P0.05)。结论Lig可能通过激活LKB1/AMPK信号通路发挥对冠心病大鼠心脏的保护作用。【关键词】甘草素;LKB1/AMPK信号通路;冠心病大鼠;心脏【中图分类号】R-332Study on Protect
5、ive Effect of Liquiritigenin on the Heart of Rats with Coronary Heart Disease by Regulating LKB1/AMPK Signal Pathway.Lian Qiang.Chengdu Third Peoples Hospital,Chengdu,Sichuan 610000,China.Abstract)Objective To investigate protective effects of liquiritigenin(Liq)on the heart of rats with coronary he
6、art dis-ease by regulating liver kinase B1(LKB1)/adenylate activated protein kinase(AMPK)signal pathway.Methods Wistar rats wererandomly divided into control group and model group.The model group was fed with high-fat diet and intraperitoneal injection of pi-tuitrin to establish the rat model of cor
7、onary heart disease,the coronary heart disease rats with successful modeling were randomlydivided into coronary heart disease group,Liq low dose(Liq-L)group(100 mg/kg Liq),Liq high dose(Liq-H)group(300 mg/kgLiq),and Liq-H+Radicicol group(300 mg/kg Liq+40 mg/kg Radicicol).After intervention,serum was
8、 collected to detect cardi-ac function left ventricular end systolic diameter(LVSD),ejection fraction(EF),left ventricular end diastolic diameter(LVDD),left ventricular shortening fraction(FS)J and blood lipid levels total cholesterol(TC),triglyceride(TG),high-density lipoprotein(HDL)and low-density
9、 lipoprotein(LDL)J.Serum inflammatory factor interleukin(IL)-1,IL-6,tumor necrosis factor-(TNF-)J and oxidative stress factor glutathione(GSH),superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)J were detec-ted by ELISA.Cardiac tissue was isolated,HE staining was used to observe histopathological chan
10、ges.And Western blot was used todetec p-AMPK/AMPK and LKB1 in tissues.Results Compared with control group,cardiac tissue of rats in the coronary heart dis-ease group was in disorder,with a large number of inflammatory cells infiltrating,IL-1,IL-6,TNF-,TC,TG,LDL,LVSD,LVDDand MDA in rats increased obv
11、iously.However,p-AMPK/AMPK,LKB1,HDL,EF,FS,SOD and GSH decreased obviously(P 0.05).Compared with coronary heart disease group,pathological damage in Liq-L group and Liq-H group was alleviated,IL-1,IL-6,TNF-,TC,TG,LDL,LVSD,LVDD and MDA decreased obviously,however,p-AMPK/AMPK and LKB1,HDL,EF,FS,SODand
12、GSH increased obviously(P0.05).Compared with Liq-H group,pathological damage in Liq-H+Radicol group was aggrava-【文献标志码】A【文章编号】10 0 4-0 50 1(2 0 2 3)0 9-0 9 16-0 5四川医学2 0 2 3年9 月第44卷(第9 期)SichuanMedicalJournal,2023,V o l.44,No.9ted,IL-1,IL-6,TNF-,TC,TG,LDL,LVSD,LVDD and MDA in rats increased obviousl
13、y.However,p-AMPK/AMPK,LKB1,HDL,EF,FS,SOD and GSH decreased obviously(P0.05).Conclusion Liq could protect heart of coronary heart disease ratsby activating LKB1/AMPK signal pathway.Key words】l i q u i r i t i g e n i n;LK B1/A M PK s i g n a l p a t h w a y;c o r o n a r y h e a r t d i s e a s e r a
14、 t s;h e a r t917:冠心病是心血管疾病之一,是全世界人口死亡的主要原因之一,开发新的治疗方法意义重大 。甘草素(liquiritigenin,Liq)属于类黄酮的一种,具有多种生物活性,包括抗氧化应激、抗炎和抑制细胞凋亡等 2 ,但其对冠心病的治疗研究甚少。肝激酶 B1(LK B1)/腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)信号通路是与炎症反应及氧化应激相关的经典通路,被证明与心脑血管疾病相关 3。本研究旨在探讨Liq 是否通过调控LKB1/AMPK信号通路,发挥对冠心病大鼠的心脏保护作用。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物:清洁级健康雄性Wistar大鼠53只,由广州兆科眼科药物
15、有限公司提供,体质量2 2 0 250g7周龄,许可证号:SYXK(粤)2 0 2 2-0 2 8 0。饲养条件:室温(2 41)、相对湿度(555)%、明暗交替12 h,喂养1周适应环境。该研究已获得动物护理和使用委员会的批准。1.1.2实验试剂与仪器:Liq购自武汉天植生物技术有限公司;垂体后叶注射液购自青岛海汇生物化学制药有限公司;LKB1抑制剂-Radicicol购自美国MedChe-mExpress公司;白细胞介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-购自威尔生物科技有限公司;谷胱甘肽(G SH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究
16、所;细胞裂解液购自索宝莱科技有限公司;Abcam公司提供LKB1、p-AMPK、A M PK 一抗。Multiskan MK2酶标仪购自LabsystemLtd;离心机购自上海安亭科学仪器厂;电泳仪购自北京六一仪器厂;小动物超声成像系统购自Visu-alSonics Inc。1.2方法1.2.1冠心病大鼠模型的制备及干预:喂养1周的大鼠随机分为对照组(10 只)、造模组(43只),造模组大鼠参照文献 4 进行构建冠心病大鼠模型:前6 周喂养高脂饲料(4%胆固醇、10%猪油、5%白糖、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧啶和8 0.3%普通饲料),之后3d连续腹腔注射 30 U/kg垂体后叶素。对照
17、组大鼠在前6周内饲喂普通饲料,然后腹腔注射等量生理盐水,每日1次。末次注射结束30 min后,心电图显示T波抬高,ST段抬高超过0.1mV,冠心病大鼠模型建造成功。该过程共3只大鼠死亡,其余40 只均造模成功,将造模成功的大鼠随机分为冠心病组、Liq低剂量(Liq-L)组、Liq 高剂量(Liq-H)组、Liq-H+Radicicol 组,每组 10只。Liq-L组、Liq-H组分别灌胃10 0 mg/kg、30 0 mg/k gLiq,同时尾部注射等体积的生理盐水干预 5;Liq-H+Radicicol 组以30 0 mg/kgLiq灌胃,同时以尾部注射40mg/kgRadicicol干预
18、6 ;对照组及冠心病组以等体积的生理盐水进行灌胃及尾部注射干预,以上各组每天各干预1次,连续进行2 周。1.2.2心功能检测:干预结束后,戊巴比妥钠麻醉大鼠,超声心动图评估心功能。心脏功能的参数包括:左心室收缩末期直径(LVSD)、左心室舒张末期直径(LVD D)射血分数(EF)和左心室缩短分数(FS)。1.2.3样本采集:心功能检测结束后,大鼠仰卧位固定在手术台上,用剪刀剪开腹部皮肤和肌肉,暴露腹部主动脉,用注射器采集5ml 血液,离心2 0 min(3000 r/min),收集上清液保存-2 0 备检。然后开胸暴露心脏,采集心脏组织,一部分固定在多聚甲醛溶液中,另一部分心脏组织于-8 0
19、冰箱保存。1.2.4血脂水平检测:取1.2.3中的血清样本,通过自动生化分析仪测量大鼠血脂水平,包括总胆固醇(T C)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)水平。1.2.5ELISA检测血清中炎性因子及氧化应激因子水平:取1.2.3中的血清样本,按照ELISA试剂盒说明检测血清中炎症因子IL-1、I L-6、T NF-以及氧化应激因子SOD、G SH 和 MDA水平。1.2.6HE检测心脏组织病理学变化:取1.2.3中固定的心脏组织,制作石蜡标本,沿心室长轴连续切片,厚度为4m,贴附于载玻片上,6 0 烘烤4h。载玻片918在二甲苯中浸泡10 min,脱
20、蜡2 次,然后分别用10 0%、95%、9 0%和7 0%的乙醇漂洗1次,每次5min。之后用无菌水冲洗2 min,苏木精染色5min,洗去多余染液。用无菌水浸泡15min,伊红染色2 min,然后分别用7 0%、9 0%、9 5%和10 0%乙醇脱水2 min,二甲苯浸泡2 min,用中性树脂密封,于显微镜下观察组织病理学变化。1.2.7Western Blot 检测组织中 LKB1、p-A M PK、AMPK蛋白表达:取1.2.3中冰箱保存的心脏组织,每份样品重量约10 0 mg。加人10 0 0 lRIPA细胞裂解缓冲液,离心5min(30 0 0 r/mi n),收集上清液。将蛋白质样
21、品加人到SDS-PAGE孔中,间隔胶8 0 V电泳30min,分离胶12 0 V电泳1h。跨膜封孔后,加人1:10 0 0 稀释的LKB1、P-A M PK、A M PK 抗体,TBST洗膜3次,最后加人二抗孵育,使用ECL试剂盒检测蛋组别对照组冠心病组Liq-L组Liq-H 组Liq-H+Radicicol 组注:与对照组比较,P0.05;与冠心病组比较,P0.05;与Liq-L组比较P0.05;与Liq-H组比较,P0.052.2Liq对各组大鼠血脂水平的影响:与对照组相比,冠心病组大鼠 TC、T G、LD L显著增加,但 HDL显著降低(P0.05);与冠心病组相比,Liq-L组、Liq
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