改造乙酰羟酸合成酶提高L-亮氨酸产量.pdf
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1、研究论文改造乙酰羟酸合成酶提高L-亮氨酸产量刘宁 1.2,徐建中1,2(1.江南大学生物工程学院,江苏无锡2 1412 2;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122)摘要:乙酰羟酸合成酶(acetohydroxyacid synthaseAHAS,编码基因iluBN)是L-亮氨酸合成途径的第一个限速酶。以谷氨酸棒杆菌XL-3(Corynebacterium glutamicum XL-3)为底盘细胞,通过分析并改造AHAS增加其对底物丙酮酸的偏好性,从而提高L-亮氨酸产量。首先利用AHAS的氨基酸序列进行同源建模,根据蛋白质结构进行丙氨酸扫描,找到突变的潜在位点,通过测定
2、突变体酶活力和重组菌株的L-亮氨酸产量寻找最适突变体。测定结果发现将157 位Gln突变成Arg能够有效提高AHAS催化丙酮酸的能力,最终重组菌株的L-亮氨酸产量达到(2 3.51.8)g/L,比出发菌株谷氨酸棒杆菌XL-3增加了51%,同时副产物L-异亮氨酸产量有所下降。因此,通过对AHAS的理性改造促进了L-亮氨酸的合成,该研究结果对后续利用蛋白质工程强化微生物合成L-亮氨酸等支链氨基酸具有重要的参考价值。关键词:乙酰羟酸合成酶;谷氨酸棒杆菌;L-亮氨酸;支链氨基酸;蛋白质改造中图分类号:Q814.9文章编号:16 7 3-16 8 9(2 0 2 3)0 9-0 0 45-11DOl:1
3、0.12441/spyswjs.20220228003Improvement of L-Leucine Production by Modifying Acetohydroxy AcidSynthaseLIU Ningl,XU Jianzhongn.(1.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of IndustrialBiotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)Abstra
4、ct:Acetohydroxy acid synthase(AHAS,encoded by the gene ilwBM)is the first rate-limitingenzyme in L-leucine synthesis pathway.Corynebacterium glutamicum XL-3 was used as the chassiscell to increase its preference for pyruvate and improve the yield of L-leucine by analyzing andmodifying AHAS.Initially
5、,the amino acid sequence of AHAS was used for homologous modeling.Then potential mutation sites were identified through alanine scanning of the protein structure.Theoptimal mutant was selected by measuring the catalytic activity of the mutant and the L-leucine yieldof the recombinant strain.The resu
6、lts showed that substituting Gln157 with Arg effectively enhancedthe ability of AHAS to catalyze pyruvate,resulting in a final L-leucine production of(23.5+1.8)g/Lin the recombinant strain,which was a 51%increase compared to the parent strain Corynebacteriumglutamicum XL-3.In addition,the yield of b
7、y-products L-isoleucine decreased.Therefore,therational modification of AHAS could promote the synthesis of L-leucine.The research results have收稿日期:2 0 2 2-0 2-2 8 修回日期:2 0 2 2-0 5-0 8基金项目:江苏省研究生科研与实践创新计划项目(SJCX20_0745)。*通信作者:徐建中(198 4一),男,博士,副教授,硕士研究生导师,主要从事微生物代谢改造研究。E-mail:x u j i a n z h o n g j
8、i a n g n a n.e d u.c n食品与生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第9期45RESEARCHARTICLELIU Ning,et al:Improvement of,L-Leucine Production by ModifyingAcetohydroxy Acid Synthaseimportant implications for the subsequent use of protein engineering to strengthen the microbialsynthesis of branched-chain amino acids such as L-
9、leucine.Keywords:acetohydroxy acid synthase,Corynebacterium glutamicum,L-leucine,branched-chainamino acids,protein engineeringEMPL-亮氨酸是主要的支链氨基酸之一,主要应用葡萄糖于食品、医药、动物饲料和化妆品行业。目前工业生产L-亮氨酸的主要方法是微生物发酵法、直接提取法和化学合成法。微生物发酵法由于成本低、环境友好等优点而被广泛运用,工业常用的菌株为谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌2。在谷氨酸棒杆菌中,L-亮氨酸生物合成与L-异亮氨酸和L-缬氨酸合成密切相关,因为这3个支链氨
10、基酸都以丙酮酸为前体,并且代谢步骤中经过4个相同的酶催化反应3-41,依次由乙酰羟酸合成酶(AHAS,编码基因ilvBN)、乙酰羟酸异构还原酶(AHAIR,编码基因ilvC)、二羟酸脱氢酶(DHAD,编码基因iluD)以及支链氨基酸转氨酶(TAs,编码基因ilvE)催化(见图1)5-6 。其中AHAS是由两个ilvB基因编码的大亚基(催化亚基)和两个ilvN基因编码的小亚基(调节亚基)组成的四聚体。它是合成途径中的第一个限速酶,其调节亚基受L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的协同反馈阻遏,作用原理是其能与AHAS的调节位点结合,从而抑制AHAS活性7 。在大肠杆菌(Es c h e r ic
11、 h ia c o li)和鼠伤寒杆菌(Salmonellatyphimurium)中,AHAS存在3种同工酶,分别是AHASI、A H A SI I 和AHASIII,由操纵子ilvBN、ilvGMEDA和ivIH所编码,但并不是全部的细菌都有多种AHAS同工酶,在谷氨酸棒杆菌中就只存在一种AHAS。在谷氨酸棒杆菌中,AHAS主要是受L-氨酸的反馈抑制,并且其可以同时催化2 个反应,第一个反应是催化丙酮酸生成2-乙酰乳酸,进人L-亮氨酸和L-氨酸的合成途径;第二个反应则是催化2-酮基丁酸和丙酮酸生成2-乙酰-2-羟基丁酸,进而合成L-异亮氨酸8-9。因此,AHAS在支链氨基酸的合成过程中占有
12、重要的地位。目前对AHAS的蛋白质改造主要集中于降低其对支链氨基酸的敏感性,从而来降低支链氨基酸的反馈抑制0 。Guo等发现A42V、A 8 9V、K 136 E、A42V、A 8 9 V 这些突变位点对于AHAS的蛋白质改造具有一定意义l;Zhang等首先过表达基因ilvBN,然后将47 位异亮氨酸突变成酪氨酸来减少46JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 9 2023丙酮酸AHASilvBN2-乙酰乳酸NADPHNADP.42,3-二氢异戊酸乙酰-CoA2-酮基异戊酸CoARleu.AC-IPMS2-异丙基苹果酸NAD
13、NADH2-酮基-4-甲基泛酸TAsNADPHilvENADPL-亮氨酸图1L-亮氨酸合成代谢途径Fig.1Metabolic pathway of synthetic L-leucine反馈抑制,最终重组菌株的L-亮氨酸产量达到了32.1g/L2l;Hasegawa等发现如果将谷氨酸棒杆菌中iluN基因的156 位Gly定点突变成Glu,并且敲除谷氨酸棒杆菌中的ldhA基因,同时过表达iluBNCDE可以有效提高AHAS抗反馈抑制的能力,结合工艺优化后L-缬氨酸产量可达2 2 7 g/L3;Lu等通过定点诱变技术,定点诱变AHAS调节亚基上的位点(N11S、T 34I、A 36 V、T 10
14、 4S、N11F、G 14E和N29H),使突变体对L-异亮氨酸敏感性显著下降4。同时,在代谢工程方面对AHAS的改造也有一定的进展。Hou等在黄色短杆菌中串联表达经定点突变的iluEBNC基因,L-缬氨酸产量达到了38 g/L5;Wang等将基因ilwBNC的原始启动子替换成Pug启动子后,重组菌株最终摇瓶发酵可获得2 8.47 g/L的L-亮氨酸;崔毅引入L-缬氨酸生产菌中的AHAS突变体,最终分批补料发酵生产39.8 g/L的L-亮氨酸9;陈宁等改变中心碳代谢途径,最终使得L-亮氨酸的产量(53.0 g/L)提高10.0%g。在谷氨酸棒杆菌中,AHAS对2-酮基丁酸的亲和力明显高于丙酮酸
15、,所以当丙酮酸和2-酮基丁酸同时存在时,AHAS会优先利用2-酮基丁酸合成L-异亮氨酸7。由此可以推测出当存在较高含量的2-酮基丁酸时,可能会造成L-缬氨酸和L-亮氨酸的合成受限制而造成生长缺陷18,从而不利于L-亮氨酸的积累。作者通过蛋白质改造工程对AHAS进2-酮基丁酸2-乙酰-2-羟基丁酸AHAIRNADPNADPHivc2,3-二氢-3-甲基戊酸DHADibvDTAsilvEL-缬氨酸2-酮基-3-甲基戊酸NADPHNADPL-异亮氨酸支链氨基酸研究论文刘宁,等:改造乙酰羟酸合成酶提高L-亮氨酸产量行理性改造,针对其底物偏好性做出优化,利用同源建模和分子模拟找出合适突变位点,筛选出最优
16、突变体来提高AHAS对丙酮酸的催化能力,从而提高L-亮氨酸产量。材料与方法1.1主要试剂异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、2 x Ph a n t aMax Master Mix、2 x T a g M a x M a s t e r M i x (D y e Pl u s)、卡那霉素:南京诺唯赞生物科技有限公司产品;限制性内切酶、DNA连接酶:赛默飞世尔科技有限公司产品;酵母提取物、胰蛋白陈:英国Oxoid公司产主要菌株以及质粒C.glutamicum XL-3BL21/pET-28a-ilvBNBL21/pET-28a-ilb BIVshrBL21/pET-28a-ilvBNAgl3s
17、lsBL21/pET-28a-ilBIVChn54ysBL21/pET-28a-ilvBIVCh17Ag菌BL21/pET-28a-iluBNVSt38hw/Agl381s株BL21/pET-28a-iluBIVSse381w/Ch1541lsBL21/pET-28a-ilBNSes8nw/Ch157AngBL21/pET-28a-iloBNAgl3sl/Chi14lysBL21/pET-28a-ilbBINAagl3ly-Ch17AgBL21/pET-28a-ilbBINGhn154lsyCh157ArgC.glutamicum XL-3-1pET-28apK18mobsacBpET-28a
18、-ilvBNpET-28a-ilvBNVser38AlapET-28a-ilvBNle2Ala质pET-28a-ilvBINPo134Ala粒pET-28a-ilvBNAg138AlapET-28a-ilvBIVCh154AlapET-28a-ilvBIVse15AlapET-28a-ilvBIVClnls7AlapET-28a-ilvBIVSerashrpET-28a-iluBVArg/38ys品;质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒、定点突变试剂盒:上海生工生物工程股份有限公司产品。1.2菌株与质粒出发菌株为作者所在实验室保藏的C.glutamicum XL-3,由菌株 C.gl
19、utamicum XQ-9诱变而来的一株L-亮氨酸生产菌株19。本研究中利用质粒pET-28a进行蛋白质表达,利用质粒pK18mobsacB进行基因的敲除或替换,大肠杆菌JM109用于质粒构建,大肠杆菌BL21(DE3)用于表达目的蛋白质。本实验中所用的主要菌株与质粒如表1所示,所用引物如表2 所示。表1本研究中用到的菌株和质粒Table 1Strains and plasmids used in this study相关特性L-亮氨酸生产菌株菌株E.coliBL21携带质粒pET-28a-ilvBN菌株E.coli BL21携带质粒 pET-28a-ilu BVNsashr菌株E.coli
20、BL21携带质粒 pET-28a-ilbBNArl3sls菌株E.coliBL21携带质粒pET-28a-ilvBINChi54ls菌株E.coliBL21携带质粒pET-28a-iluBINCh157Ag菌株 E.coli BL21携带质粒 pET-28a-ilbBVNs38mwagl380s菌株 E.coli BL21携带质粒 pET-28a-ilbBNs38hiwChn54s菌株E.coli BL21携带质粒 pET-28a-iluBNSasniwChn17ng菌株E.coliBL21携带质粒pET-28a-iloBNAr138liyChn154y菌株E.coli BL21携带质粒pET
21、-28a-ilbBNAagl3lyCh157ag菌株E.coli BL21携带质粒pET-28a-ilu BNCh154ywChn157ag菌株C.glutamicumXL-3携带突变基因iluBINChn157AngC.glutamicum中敲除质粒pET-28a携带基因ilBNpET-28a携带突变基因iluBINSe38AlapET-28a携带突变基因iluBNVle2AlapET-28a携带突变基因iluBNPo134AlapET-28a携带突变基因ilvBNAag138AlapET-28a携带突变基因iluBINChn154AlapET-28a携带突变基因iluBNVSe15Slap
22、ET-28a 携带突变基因 iluBCh157AlapET-28a携带突变基因iluBNSeashrpET-28a携带突变基因ilvBNAng1381ys来源作者所在实验室保藏本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建表达质粒作者所在实验室保藏作者所在实验室保藏本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第9 期47RESEARCHARTICLELIU Ning,et al:Improvement of,L-Leuci
23、ne Production by ModifyingAcetohydroxy Acid Synthase续表1主要菌株以及质粒pET-28a-ilBNCh154lyspET-28a-iluBVClh157ArgpET-28a-iluBNSer38nhwAg38lyspET-28a-iluBNSer381ha/Ch154lys质pET-28a-ilvBINSeshaCh157Arg粒pET-28a-iluBNAg/38IyChn154lyspET-28a-iluBNArg38lywCn1s7AgpET-28a-ilvBINCln154ly/Cln157AgpK18mobsacB-iluBNpK1
24、8mobsacB-ilvBINCh157Ang引物pET-28a-ilvBN-FpET-28a-ilvBN-Rilo BIVsa3sAl-RiluB/Nle2Al-Rilo BIVPbol3Al-Filbo BINPo134Ala-RiluBNAng/38Al-Filo BIVChi54Al-Fily BIVClnsAl-RiluBIVChi17Al-Filu BINCh157Al-RiloBINSe38shnr-Filu BIVChis4Is-Filu BINChi54ls-RiloBINChI57Ar-Filu BINChI57Arm-RpK18-iluBN-FpK18-iluBN-RpK
25、18-ilvBINChis7An-FpK18-ilvBINChi57Are-R相关特性pET-28a携带突变基因ilvBINChis41spET-28a携带突变基因ilvBIVCh157ArgpET-28a携带突变基因iluBNVSe38mu/Ag13810spET-28a携带突变基因iluBIVSe38ma/Ch14lspET-28a携带突变基因iluB/VSa38haChn157AngpET-28a携带突变基因iluBNAg138lyCh14spET-28a携带突变基因iluBINAag1381owCh157AngpET-28a携带突变基因iluBINChn154lgyCh157AngpK
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