改良线栓法建立SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型.pdf
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1、神经损伤与功能重建2023年10月第18卷第10期论著改良线栓法建立SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型陈超1,聂郁林2,陆心恬1,林玥伶1,龙颖1,李金声1作者单位1.深圳市人民医院高压氧科深圳 5180202.深圳市龙岗区第二人民医院高压氧室深圳 518112收稿日期2023-03-09通讯作者李金声摘要目的:建立一种SD大鼠局灶性脑缺血再灌注改良模型,以降低模型制备难度,提高模型的稳定性。方法:SD雄性大鼠30只,随机分为模型组24只和假手术组6只。采用经改良的颈外动脉进线栓法建立模型,并通过神经功能缺损评分、伊文思蓝(EB)染色及TTC染色进行综合评价。结果:该改良方法建模成功率为87.5%
2、,梗死区可明显看到EB渗出,TTC染色显示梗死体积占大脑总体积的(10.654.41)%。结论:经改良后,明确了颈总动脉结扎位置,以及颈外动脉结扎、剪断位置,采用颈外动脉残端直接进线栓建立模型,降低了模型制备难度,提高了模型的稳定性和成功率。关键词脑缺血再灌注;颈外动脉;伊文思蓝染色;TTC染色中图分类号 R741;R741.02;R743 文献标识码ADOI10.16780/ki.sjssgncj.20230180本文引用格式:陈超,聂郁林,陆心恬,林玥伶,龙颖,李金声.改良线栓法建立SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型J.神经损伤与功能重建,2023,18(10):569-573.Modifie
3、d Thread Embolization Method for Establishment of Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Model in SD RatsCHEN Chao1,NIE Yulin2,LU Xintian1,LIN Yueling1,LONG Ying1,LI Jinsheng1.1.Department of Hyperbaric Oxygen,Shenzhen People s Hospital,Shenzhen 518020,China;2.Department ofHyperbaric Oxygen,The Second
4、People s Hospital of Longgang District,Shenzhen 518112,ChinaAbstract Objective:To establish a modified thread embolization method for the establishment of a model offocal cerebral ischemia-reperfusion in SD rats,to reduce the difficulty of model establishment and improve thestability of the model.Me
5、thods:Thirty male SD rats were randomly divided into a model group of 24 and asham operation group of 6.The modified external carotid artery approach was used to establish the model,andcomprehensive evaluations were performed by using neurological function scores,Evans blue(EB)staining,andTTC staini
6、ng.Results:The successful rate of model establishment was 87.5%,and obvious EB extravasationcould be observed in the infarction zone,and the infarction volume accounted for(10.65 4.41)%of the totalbrain volume according to TTC staining.Conclusion:After modification,the location of ligation of common
7、carotid artery and external carotid artery,as well as the cutting position of external carotid artery were clarified.Direct application of the remaining external carotid artery to establish the model reduced the difficulty of modelestablishment,improved the stability and increased the success rate o
8、f the model.Keywordscerebral ischemia-reperfusion;external carotid artery;Evans blue staining;TTC staining脑卒中具有高发病率、高致残率、高死亡率及高复发率的特点,其中缺血性脑卒中约占80%1。药物溶栓或机械取栓是治疗急性缺血性脑卒中的有效治疗方法,但脑缺血再灌注会加重缺血部位神经元损伤2。建立稳定可靠的脑缺血再灌注模型对研究脑缺血再灌注损伤的预防、治疗及预后等具有重要意义。在现有文献中,颈外动脉进线建模方法多在颈外动脉上打2个线结,在颈外动脉盲端剪一“V”形切口,从“V”形切口进线栓,这占
9、用了较长的颈外动脉血管,如处理不当易引起大出血;且在颈外动脉盲端上剪一小口提高了手术的操作难度,切口剪大会造成牵拉过程中血管容易断,切口过小不利于线栓插入。此外,建模过程多以文字描述,如以近心端、远心端或距离来表示线结结扎位置,导致结扎部位不明确,不利于模型的重复性和稳定性。针对上述问题,本研究对Longa等3-9建模方法进行优化,明确了颈总动脉预结扎位置、以及颈外动脉结扎位置和剪断位置,采用颈外动脉残端直接进线栓建立模型,以期降低模型制备难度,提高模型制备的稳定性和成功率。1 材料与方法1.1 主要试剂与材料1.1.1实验动物67周龄、体质量160180 g的清洁级雄性SD大鼠购自广东省医学
10、实验动物中心。饲养在SPF级动物房中,室内温度(223),湿度(605)%,光照周期为12 h光照、12 h黑暗,自由食水。569Neural InjuryAnd Functional Reconstruction,October 2023,Vol.18,No.101.1.2试剂与仪器主要包括台式三目体式显微镜,电子称,戊巴比妥钠(或水合氯醛),大鼠用手术台,橡皮筋,脱毛膏,碘伏,眼科剪,眼科镊,系线镊,显微镊,4-0丝线,7-0丝线,显微弹簧剪,圆针,角针,持针钳,1 mL注射器,无菌棉签,无菌纱布,血管夹,电凝刀(BDD-YE-DT-1型、宁波市舜业医疗器材有限公司),MCAO模型线栓(M
11、SRC37B250PK50、深圳市瑞沃德生命科技有限公司),伊文思蓝(Evans blue,EB)(IE0280-100 mg、北京索莱宝科技有限公司),TTCA610558-0005、生工生物工程(上海)股份有限公司等。手术器械在建模前1天经高压蒸汽法灭菌并烘干。1.2 方法1.2.1动物分组SD雄性大鼠适应性饲养7 d,术前12 h禁食,自由饮水。手术当天体质量以240280 g为宜。30只大鼠随机分为模型组24只和假手术组6只。1.2.2改良线栓法建立模型1.2.2.1手术准备工作2%戊巴比妥钠(0.3 mL/100 g)或10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉,翻正反射
12、消失后,仰卧位固定于手术台上,颈部延展。用脱毛膏去除大鼠颈部鼠毛,碘伏进行颈部皮肤消毒。1.2.2.2颈总动脉分离、预结扎在颈部正中位置剪一约2 cm切口。剪开并分离皮下组织,可看到由胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌和二腹肌形成的“三角形”(图1-),然后钝性分离胸骨舌骨肌和胸锁乳突肌,沿胸锁乳突肌内侧逐步分离肌肉筋膜,可看到颈总动脉和迷走神经(图1-)。在体式显微镜下小心钝性分离迷走神经,剥离包裹在颈总动脉上的鞘膜。在该位置的颈总动脉置一根4-0丝线,暂不结扎(图1-)。1.2.2.3颈外动脉分离、结扎沿颈总动脉逐步分离,可看到颈外动脉及其分支(枕动脉、甲状腺上动脉)、颈内动脉及迷走神经(图2-),分
13、离血管周围组织、迷走神经,使其游离。用电凝刀依次烧断枕动脉、甲状腺上动脉(图2-)。在甲状腺上动脉分支位置的上方,用7-0丝线结扎颈外动脉(图2-)。血管分离完毕后,用7-0丝线做一个线圈(图2-),以备插线栓时用。1.2.2.4线栓头直接从颈外动脉残端进入将颈总动脉上预留的4-0丝线打活结(或用血管夹夹闭),用血管夹夹闭游离的颈内动脉,在颈外动脉结扎部位与甲状腺上动脉分支之间,用显微弹簧剪垂直血管剪断颈外动脉(剪断位置见图2-黄色虚线)。线栓头直接从颈外动脉残端插入,将预先准备好的7-0丝线圈,从线栓尾部进入并沿线栓直至颈外动脉残端处,用其绑紧颈外动脉残端,以防线栓滑脱(图3-)。移除颈内动
14、脉的血管夹,用一只系线镊夹住丝线的一端,用另一只系线镊调整栓头的方向,使其进入颈内动脉(图3-),然后用系线镊夹住线栓,缓慢推进线栓(图3-)。1.2.2.5脑缺血与再灌注线栓进入1820 mm(线栓上的黑色标记),微遇阻力时即停止,扎紧颈外动脉残端,打开颈总动脉的活结(图 4-)。记录缺血开始的时间,用浸有生理盐水的纱布覆盖伤口。缺血60 min后缓慢拔出线栓(图4-),进行再灌注。结扎颈外动脉残端(图4-)。观察无内出血后,用4-0丝线缝合皮肤,剪短线头,消毒,将大鼠放回笼子。注:胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌和二腹肌;颈总动脉(黑色箭头所指)和迷走神经(白色箭头所指);颈总动脉处置一根4-0丝线
15、,暂不结扎。图1 颈总动脉分离、预结扎注:颈总动脉,颈外动脉及其分支(枕动脉、甲状腺上动脉)、颈内动脉及迷走神经;枕动脉残端、甲状腺上动脉残端;在甲状腺上动脉分支位置的上方,用7-0丝线结扎颈外动脉;黄色虚线为剪断颈外动脉的位置;7-0丝线做的线圈。图2 颈外动脉分离、结扎注:线栓头直接从颈外动脉残端插入;调整栓头的方向,使其进入颈内动脉;用系线镊夹住线栓,缓慢推进线栓。图3 线栓头直接从颈外动脉残端进入570神经损伤与功能重建2023年10月第18卷第10期1.2.3假手术组大鼠麻醉后除不结扎血管和插入线栓外,其他操作与上述方法相同。1.2.4模型评价1.2.4.1神经功能缺损评分在大鼠清醒
16、后(建模完成后约1 h),参考Longa的评分标准进行神经功能评分。0分:无神经功能缺损症状;1分:轻度局灶性神经功能缺损,即提尾悬空对侧前爪不能完全伸展;2分:中度局灶性神经功能缺损,即行走向对侧转圈;3分:重度局灶性神经功能缺损,即行走困难,向对侧倾倒或不能自发行走;4分:不能自发行走,意识水平下降;5分:死亡。评分 13 分视为模型制备成功。1.2.4.2EB染色脑缺血再灌注72 h后,经尾静脉注入2%EB溶液(4 mL/kg),2 h后经腹腔深度麻醉,4 预冷的生理盐水进行心脏灌注,取脑,拍照。将大脑置于20 冰箱冷冻20 min,然后用锋利双面剃须刀片做连续冠状切片,拍照。1.2.4
17、.3TTC染色脑缺血再灌注72 h后,经腹腔深度麻醉大鼠,4 预冷的生理盐水进行心脏灌注,取脑,将大脑置于20 冰箱冷冻20 min,然后用锋利双面剃须刀片做连续冠状切片。将脑片置于含 1%TTC 的培养皿内,37 恒温培养箱避光染色,间隔5 min翻动脑片。染色结束后,去除TTC,用PBS轻柔冲洗2遍,拍照。使用ImageJ分析脑梗死体积10。1.3 统计学分析采用GraphPad Prism 8软件处理数据。符合正态分布以及方差齐性的计量资料以(xs)表示,组间比较采用独立样本均数t检验;P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 神经功能缺损评分模型组在术后 1 h 神经功能缺损评分为
18、(1.790.41)分,建模第2天死亡3只(其中2只为蛛网膜下腔出血,另1只原因不明),模型成功率为87.5%;假手术组术后1 h神经功能缺损评分为(0.000.00)分,无神经缺损症状,无死亡。2组神经功能缺损评分差异有统计学意义(P0.001)。2.2 EB染色脑缺血再灌注72 h后,模型组在皮质下和部分皮质的梗死区可明显看到EB渗出(为更好展示EB渗出,脑冠状切片做了正反调整),见图5-。假手术组无EB渗出。2.3 TTC染色脑缺血再灌注72 h后,模型组大脑皮质下和部分皮质的梗死区呈苍白色(为更好展示梗死区,脑冠状切片做了正反调整),见图6-。经ImageJ分析,模型组脑梗死体积占大脑
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