高产9α-OH-AD偶发分枝杆菌的诱变选育及其转化工艺优化.pdf
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1、山东农业大学学报(自然科学版),2023,54(5):657-662VOL.54 NO.5 2023Journal of ShandongAgricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2023.05.003高产高产 9-OH-AD 偶发分枝杆菌的诱变选育偶发分枝杆菌的诱变选育及其转化工艺优化及其转化工艺优化高华义,杨佳浩,何 蔓,苏振华,周海杰,申雁冰*,王 敏*工业发酵微生物教育部重点实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457摘摘 要要:偶发分枝杆
2、菌(Mycobacterium fortuitum)作为重要的 9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-OH-AD)生产菌株,在甾体药物的生产中起着重要的作用。为了进一步提高偶发分枝杆菌的 9-OH-AD 生产水平,对原始菌株进行常压室温等离子体(ARTP)诱变处理。在最佳诱变处理时间(35 s)下,筛选得到一株高产9-OH-AD的诱变株MycobacteriumfortuitumAR-2。当投加 10 g/L 植物甾醇时,转化 96 h,该菌株 9-OH-AD 摩尔生成率达 87.6%,较原始菌株提高 14.9%。进一步,对 AR-2 进行 ARTP-LiCl 复合诱变,确定最佳 LiCl
3、 诱变浓度为 3.5%,得到一株高产 9-OH-AD 的诱变菌株Mycobacterium fortuitum#91。当 RM-CD 添加量与底物摩尔比为 1:1,投加 10 g/L 植物甾醇时,该菌株 9-OH-AD摩尔生成率达 95.7%,较原始菌株提高 34.9%,具有良好的应用前景。关键词关键词:偶发分枝杆菌;诱变选育;诱变菌中图法分类号中图法分类号:Q815文献标识码文献标识码:A文章编号文章编号:1000-2324(2023)05-0657-06Mutagenesis Breeding of High-yield Mycobacterium fortuitum9-OH-AD-cou
4、pled and Optimisation of Transformation ProcessGAOHua-yi,YANGJia-hao,HEMan,SUZhen-hua,ZHOUHai-jie,SHENYan-bing*,WANGMin*Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of IndustrialMicrobiology,College of Biotechnology/Tianjin University of Science
5、&Technology,Tianjin 300457,ChinaAbstract:Mycobacterium fortuitum is an important strain for the production of 9-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione(9-OH-AD)in the manufacture of steroid drugs.To improve the 9-OH-AD production of Mycobacterium fortuitum,theoriginal strain was subjected to atmospheric pre
6、ssure room temperature plasma(ARTP)mutagenesis treatment.A mutantstrain,Mycobacterium fortuitum AR-2,with high 9-OH-AD production was screened at the optimal mutagenic treatmenttime(35 s).When transformed for 96 h with 10 g/L phytosterol,the strain achieved a molar production rate of 9-OH-AD of87.6%
7、,which was 14.9%higher than that of the original strain.Furthermore,AR-2 was subjected to ARTP-LiCl compoundmutagenesis,the optimal LiCl mutagenesis concentration was determined to be 3.5%,and a mutagenic strain Mycobacteriumfortuitum#91 with high 9-OH-AD production was obtained.When the molar ratio
8、 of RM-CD addition to phytosterol was1:1 and 10 g/L phytosterol was administered,the molar production rate of 9-OH-AD of this strain reached 95.7%,whichwas 34.9%higher than that of the original strain,and it has a good application prospect.Keywords:Mycobacterium fortuitum;mutation breeding;mutagenes
9、is9-羟基-4-雄甾烯-3,17-二酮(9-OH-AD)是生产 9位上有卤素的皮质激素的重要前体,利用9-OH-AD 可以合成氢化可的松、依普利酮、地塞米松、倍他米松、可的松、醋酸氟轻松、氟羟泼尼松龙等多种重要的甾体药物,它们被广泛用作抗肿瘤、抗炎、抗病毒和抗真菌药物,具有重要的商业价值1-3。目前 9-OH-AD 的生产方法主要以微生物转化法为主,以解决化学合成较难完成的C-9位羟基的引入4,5。分枝杆菌,红球菌和诺卡氏菌等可以使用甾醇作为唯一的碳源和能源的微生物,常用于生产 9-OH-AD3,6-8。但是,目前微生物选择性侧链降解植物甾醇(PS)制备 9-OH-AD 存在底物溶解度低、菌
10、种退化,导致菌种转化率低、转化周期较长等问题3,因此提高菌株降解 PS 生产 9-OH-AD 的能力具有重要的现实意义。诱变育种是利用合理有效的诱变方法及诱变剂处理微生物细胞,提高突变频率,再通过适当的筛选方法获得优质菌株的育种方法9。常压室温等离子体(ARTP)诱变育种,可以通收稿日期收稿日期:2022-11-11修回日期修回日期:2022-12-23基金项目基金项目:国家自然科学基金(21978221)第第 1 作者简介作者简介:高华义(1989-),男,博士研究生,专业方向:发酵工程.E-mail:*通讯作者通讯作者:Author for correspondence.E-mail:;6
11、58山东农业大学学报(自然科学版)第 54 卷过产生的等离子流改变细胞壁的结构和通透性,并引起 DNA 损伤,使细菌,真菌,酵母和其他微生物发生突变。与其他传统方法相比,ARTP 具有突变速度快、操作方便等优势9。当与其他突变方法结合使用时,其突变效率将显着提高10,11。本研究以偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)为研究对象,采用常压室温等离子体(ARTP)和 ARTP-LiCl 复合诱变技术,基于 2,4-二硝基苯肼(DNPH)能与 9-OH-AD 发生显色反应的特性进行诱变菌株的筛选10,以摇瓶转化进行复筛,筛选得到一株遗传稳定的高效 9-OH-AD 生产菌株,
12、对提高 9-OH-AD 产量,促进相关行业发展具有重要意义。1材料和方法材料和方法1.1材料和试剂材料和试剂1.1.1 菌株 偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)TCCC 111744,天津科技大学系统微生物与生物制造工程研究室保藏。1.1.2 培养基 斜面培养基(g/L):蛋白胨 5.0,牛肉浸膏 3.0,氯化钠 5.0,葡萄糖 1.0,琼脂 20.0,pH6.8。灭菌条件 121,20 min。种子培养基(g/L):磷酸氢二铵 1.5,酵母粉 9.0,甘油 20.0,磷酸二氢钠 0.5,磷酸氢二钠 0.5,吐温 80 0.5,碳酸钙 10.0,pH 调至 7.2。
13、发酵培养基(g/L):硫酸铵 1.8,尿素 0.3,磷酸二氢钠 0.8,磷酸氢二钠 0.7,吐温 80 0.2,葡萄糖 9.0,PS 适量,pH7.0。灭菌条件 121,20 min。1.1.3 主要试剂 PS 购自中粮天科生物工程(天津)有限公司,9-OH-AD 购自 Sigma Aldrich 公司,甲基-环糊精购自广州泰隆国际贸易有限公司;色谱纯甲醇购自天津市康科德科技有限公司,其他试剂均为分析纯。1.2仪器仪器ARTP 诱变系统,北京思清源生物科技有限公司;Agilent 1260 型 HPLC 仪,美国 Agilent;Epoch2微孔板分光光度计,美国 BioTek。1.3方法方法
14、1.3.1 24微孔板培养体系的确定 偶发分枝杆菌预先在种子培养液中30、200 r/min振荡培养约22 h,所得菌液分装至 24 深孔板各孔及 250 mL 摇瓶中(摇瓶装液量 20 mL),在同样条件下继续培养。根据 24 孔全挡板深孔板的容积(10 mL/孔),设计以下装液量:1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2和 2.4 mL,并以摇瓶培养作为对照,考察发酵液的菌体生长情况及挥发率,从而确定最佳装液量。每 12 h 对 24 孔全挡板深孔板内的发酵液进行 600 nm 下波长吸光值的测定和发酵液体积测量,挥发率计算公式:%1001%/0VVt挥发率。V0为培养前发酵
15、液体积(mL),Vt为每 12 h 取样时发酵液体积(mL)。1.3.2 菌悬液的制备 0.5%吐温 80 水溶液洗下新鲜偶发分枝杆菌斜面,调整 OD600=1.20.2,以 3%的接种量接种于容量为 250 mL 装有 50 mL 种子培养液的摇瓶中,30、200 r/min 振荡培养至对数期(约 2224 h)。取适量菌液于无菌的 2 mL EP 管内,9000 r/min 离心 2 min,将收集的菌体重新悬浮于吐温 80-生理盐水的水溶液中,调整其菌液 OD600=0.60.8,作为诱变时的菌悬液。1.3.3ARTP 诱变处理9取 10 L 菌悬液于无菌诱变载片上,进行 ARTP 诱变
16、处理。诱变后将诱变载片上的菌体洗下。对诱变菌悬液进行适当的梯度稀释,分别取 100 L 涂布在琼脂培养基上,30培养倒置培养后进行菌落平板计数,计算致死率。致死率的计算公式为:%100%/0UUU致死率。U 为未经诱变处理活菌数,U0为诱变处理活菌数。1.3.4ARTP 与 LiCl 复合诱变10ARTP 诱变完成后,向各装有诱变后载片的 EP 管中加入 1 mL 34%的 LiCl 溶液,37 水浴处理 30 min,间歇震荡 1 min,加 1 mL 0.9%吐温 80-生理盐水终止反应。对第 5 期高华义等:高产 9-OH-AD 偶发分枝杆菌的诱变选育659复合诱变菌悬液进行适当梯度稀释
17、,分别取 100 L 涂布在琼脂培养基上,30 培养 72 h。1.3.5 诱变菌株的初筛及复筛 挑取诱变后的单菌落,另取出发菌株作为对照,在 24 深孔板培养至OD600约为 0.8,向孔板中加入 2 g/L AD,转化 12 h 后取 0.5 mL 样品。每个样品用 2 倍乙酸乙酯萃取,取 25 L 萃取液加入至 96 孔板中,然后加入 100 L DNPH 溶液进行显色反应10,选择颜色浅的菌株进行 PS 摇瓶发酵复筛。1.3.6 甾醇转化与检测7将步骤诱变培养得到的菌落接种于斜面培养基,用 0.5%的吐温 80 无菌水溶液洗下,调整 OD600在 1.0 0.2 左右。以 3%的接种量
18、接种于装有 50 mL 种子培养液的 250 mL 摇瓶中,30,200 r/min 培养至对数生长期(2224 h),以 8%接种量接种于 50 mL 发酵液的挡板瓶中,30,140 r/min,培养 4 d,定时取样萃取,使用高效液相色谱法(HPLC)进行定量分析。样品制备:吸取 600 L 发酵液于 2 mL EP 管内,然后加入等体积的乙酸乙酯超声萃取 20 min。取有机相 100 L 置于 2mL EP 中,自然挥干。加 1 mL 80%甲醇,超声复溶,0.22 m 有机膜过滤后进行 HPLC 分析。9-OH-AD 摩尔转化率计算公式为:%100%/ADOH9ADOH9MCMCPS
19、PS摩尔产率。C9-OH-AD为 9-OH-AD 浓度(g/L),CPS为 PS 浓度(g/L),M9-OH-AD为 9-OH-AD 相对分子质量,MPS为 PS 相对分子质量。9-OH-AD 生成速率计算公式为:TCCtt21)hLg/(/生成速率。Ct1为 9-OH-AD 在时间 t1时的浓度(g/L),Ct2为 9-OH-AD 在时间 t2时的浓度(g/L),T为 t1与 t2的时间差(h)。1.3.7 诱变菌株的遗传稳定性实验 将复筛得到的高产菌株转接斜面扩大培养 5 次,每次采用 1.3.6 的方法对诱变获得的高产菌株进行稳定性验证生物转化实验,以获得遗传稳定性较好的突变菌株。1.3
20、.8 偶发分枝杆菌诱变菌株转化工艺的建立 在获得高产 9-OH-AD 诱变菌株的基础上,使用最佳的促溶介质 RM-CD,建立高浓度底物的生物转化工艺,以提高 9-OH-AD 的产量。将培养约 22 h的种子培养液,按 8%的接种量接种于含有不同量 RM-CD 的 50 mL 的发酵培养基中(RM-CD 与PS 的摩尔比为 0.25:1,0.5:1,1:1,1.5:1,2:1,3:1),考察 RM-CD 添加量对转化的影响。以同样的方法,将种子液接种于含有不同 PS 投加量的 50 mL 发酵培养基中(8 g/L,10 g/L,12 g/L,15 g/L,20 g/L),考察 PS 添加量对转化
21、的影响。1.4数据处理数据处理所有数据均用 Excel 和 Origin 2021 软件处理,采用 ANOVA 分析组间差异显著性,差异显著性的水平设置为 P0.05。2结果与分析结果与分析2.124 微孔板培养体系的确定微孔板培养体系的确定24 微孔板培养是本研究筛选方法建立的基础,菌种在 24 微孔板中的生长状态会直接影响实验筛选的准确性。如表 1 所示,24 微孔板的装液量越少,液体挥发越严重,当微孔板装液量在 1.4 mL以下时,液体挥发率明显高于 24 微孔板中的其它装液量,且菌体几乎不生长。当装液量为 1.6 mL以上时,其液体挥发率明显低于摇瓶,装液量为 2.0 mL 的挥发率较
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- 高产 OH AD 偶发 分枝杆菌 诱变 选育 及其 转化 工艺 优化
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