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高抗氧化活性黑皮鸡枞优良菌株筛选.pdf
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1、南方农业South China Agriculture第17卷第15期Vol.17 No.152023年8月Aug.2023黑皮鸡枞(Hymenopellis raphanipes)是长根菇的商品名,又名长寿菇、露水鸡枞、卵孢小奥德蘑、二孢拟奥德蘑,俗称黑皮鸡枞菌,是近年来食用菌工厂化栽培的热门菌种之一。其在分类学上属担子门伞菌纲伞菌目膨瑚菌小奥德蘑属1。由于黑皮鸡枞菌香味馥郁,肉质鲜嫩,含有丰富的氨基酸、维生素、多糖及矿物质元素等多种营养成分,并有抗氧化2、保护肝脏3-4、调整肠道菌群5、抑制病原菌6等生物活性,具有极高的食药用价值,受到众多消费者的喜爱。卢彩会等人测定黑皮鸡枞水提物和醇提物
2、的抗氧化活性,证实了2种提取物对DPPH自由基、羟自由基和ABTS自由基均有较好的清除能力,对铁离子的还原能力随着添加量的增加而逐渐提高,且水提物比醇提物的抗氧化能力更强2;安晓雯等则通过比较分析黑皮鸡枞、平菇、海鲜菇、白玉菇、香菇和金针菇等6种食用菌的营养成分、抗氧化活性等,得出黑皮鸡枞的抗氧化能力最高7。因此,选育高抗氧化活力的菌株对于黑皮鸡枞产业的高质量发展具有重要意义。目前,国内外研究人员对黑皮鸡枞的研究重点在其营养成分和培养条件优化等方面,鲜见关于对不同黑皮鸡枞菌株抗氧化活性的报道。本试验通过比较8个黑皮鸡枞菌株筛选出高抗氧化活性的优良菌株,以期对黑皮鸡枞的深加工提供理论指导。1材料
3、与方法1.1试验材料1.1.1供试菌株供试 8 个黑皮鸡枞菌株编号分别为 HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8,全部由福建农林大学生命科学学院生物工程专业实验室馈赠。1.1.2培养基斜面培养基(PDA):土豆 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 20 g,蒸馏水定容至 1 L,pH 自然。115 灭菌30 min,缓慢冷却。加富培养基:葡萄糖 20 g、蛋白胨 2 g、酵母粉2 g、KH2PO42.5 g、MgSO47H2O 1 g、琼脂20 g,蒸馏水定容至1 L,pH自然。115 灭菌30 min。收稿日期:2023-02-23作者简介:李春兰(1993),女,江
4、西赣州人,硕士,研究方向为食用菌种植。E-mail:。*为通信作者,E-mail:。李春兰,李佳欢,胡开辉,等.高抗氧化活性黑皮鸡枞优良菌株筛选J.南方农业,2023,17(15):29-33.高抗氧化活性黑皮鸡枞优良菌株筛选李春兰1,李佳欢2,胡开辉2,梁鹏1*(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002;2.福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002)摘要通过观察8株黑皮鸡枞菌株固体、液体发酵过程中菌丝生长情况,比较其发酵液营养成分,以ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率等抗氧化能力指标对菌株进行筛选。结果:菌株HP1的菌丝活力强,菌球干重大,为0.8
5、27 1 g(100 mL)-1;发酵液还原糖含量为50.29 mgmL-1,可溶性蛋白含量为38.47gmL-1;抗氧化物质含量高,总酚、总黄酮含量为240.12、23.23 gmL-1;抗氧化能力最强,其稀释液对 ABTS 自由基、DPPH 自由基、羟自由基的清除率为 54.28%、78.08%、66.06%,对铁离子的还原能力最强,吸光度为0.598。结果表明,黑皮鸡枞HP1菌株长势优良、菌丝浓密,富含黄酮、总酚等活性物质,抗氧化能力强,可用于后续黑皮鸡枞抗氧化产品的开发利用。关键词黑皮鸡枞;菌株筛选;菌种培养;抗氧化活性中图分类号:Q939.99文献标志码:ADOI:10.19415/
6、ki.1673-890 x.2023.15.00629南方农业South China Agriculture第17卷第15期Vol.17 No.152023年8月Aug.2023液体培养基:葡萄糖 20 g、蛋白胨 2 g、酵母粉2 g、KH2PO42.5 g、MgSO47H2O 1 g,蒸馏水定容至1 L,pH自然。115 灭菌30 min。1.1.3试剂和仪器试 剂:葡 萄 糖、蛋 白 胨、酵 母 粉、KH2PO4、MgSO47H2O、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝 G-250、ABTS、DPPH、无水乙醇、水杨酸、FeSO47H2O、无水碳酸钠、过氧化氢等。仪器:超净工作台、水浴锅、酶标仪、紫
7、外分光光度计、电磁炉、制冰机、离心机、分析天平、高压灭菌器等。1.2试验方法1.2.1菌株活化将4 保藏的黑皮鸡枞菌株接种于PDA固体斜面培养基进行活化,置于25 生化培养箱内培养10 d左右;选取已活化好的试管菌株进行扩大培养,用接种钩挑取0.5 cm0.5 cm接种块接种于加富培养基平皿中心,于25 恒温培养,48 h后倒置培养。1.2.2液体菌种的制备将200 mL液体培养基装入500 mL摇瓶中,115 灭菌30 min,冷却备用。将已经活化好的平皿刮去气生菌丝,再使用8 mm打孔器在距旧接种块相同距离处进行打孔,取25个接种块于液体培养基中,25 培养24 h,再放入25、150 r
8、min-1摇床中培养。第3天开始用磁力搅拌器搅拌20 mind-1,培养5 d。1.2.3摇瓶发酵250 mL 摇瓶装 100 mL 液体培养基,115 灭菌30 min,冷却备用。液体菌种接种,接种量为5%,25、150 rmin-1摇床发酵6 d。培养完成后将发酵液进行过滤,测定菌球湿重、干重,再将发酵液9 000 rmin-1离心15 min,测定还原糖、总酚等活性物质含量及发酵液的抗氧化活性。1.3测定指标及方法1.3.1菌丝生长性状观察各菌株菌丝在加富培养基上的生长状态,采用“十”字交叉法测定菌落半径(R),用游标卡尺测量生长长度,单位为mm;液体发酵,观察菌球生长情况,发酵结束测定
9、生物量。菌丝生长速度按以下公式计算。菌丝生长速度=R2-R1t(1)1.3.2还原糖含量测定发酵液中还原糖含量测定采用3,5-二硝基水杨酸法8,稍作修改。以葡萄糖为标准品。取适当稀释的发酵液 0.5 mL,再加入 0.75 mL DNS试剂,混匀,沸水浴7 min后立即放入冰水混合物中冷却,然后定容至5 mL,于540 nm处测定吸光度(A)。1.3.3可溶性蛋白含量测定发酵液中可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝染色法9,稍作修改。以牛血清白蛋白为标准品。取适当稀释的发酵液1 mL,加入5 mL Bradford工作液,显色10 min后在595 nm下测定吸光度(A)。1.3.4总酚含量测定发
10、酵液中总酚含量测定采用 Folin-Ciocalten法10,稍作修改。以没食子酸(Gallic acid)为标准品。25 L适当稀释的发酵液加入 96孔板中,然后加入 125 L福林酚试剂,室温下反应 10 min 后加入 125 L 饱和Na2CO3溶液,振荡器上摇 1 min,摇匀后室温下放置反应30 min,然后在765 nm下测定吸光度。1.3.5总黄酮含量测定采用氯化铝络合分光光度法测定发酵液总黄酮含量11,稍作修改。以芦丁为标准品。取适当稀释的发酵液50 L于96孔板中,依次加入100 L的AlCl3和50 L醋酸-醋酸钠缓冲液,摇匀40 反应15 min,于400 nm处测定吸
11、光度。1.3.6ABTS自由基清除活性测定参照Re R等12测定ABTS抗氧化能力方法并稍作修改。以VC作阳性对照。取250 L发酵液于10 mL容量瓶中,蒸馏水定容。在96孔板中加入75 L稀释的发酵液,再加入 125 L的 ABTS工作液,缓慢摇匀,避光放置15 min,在734 nm下测定吸光度(As),同时取75 L蒸馏水代替稀释液测得空白吸光度(Ac),以无水乙醇代替 ABTS 工作液测得稀释液本底吸光度(Aj)。每个样品做4个平行,取其平均值。清除率计算公式为:清除率=Ac-()As-AjAc 100%(2)1.3.7DPPH自由基清除活性测定参照赵琳琳等13测定DPPH清除自由基
12、能力方法30南方农业South China Agriculture第17卷第15期Vol.17 No.152023年8月Aug.2023并稍作修改。以 VC作阳性对照。取 2.5 mL发酵液于10 mL 容量瓶中,蒸馏水定容。在 96 孔板中加入100 L稀释液,再加入100 L的DPPH溶液,室温避光震荡 30 min,在 517 nm 下测定吸光度(As),取100 L水代替稀释液测得空白吸光度(Ac),以无水乙醇代替DPPH溶液测得稀释液本底吸光度(Aj)。每个样品做4个平行,取其平均值。按公式(2)计算清除率。1.3.8羟自由基清除活性测定参照 Liu Y等14测定羟自由基清除能力时采
13、用的水杨酸法并稍作修改。以 VC做阳性对照。取 250 L发酵液于10 mL容量瓶中,蒸馏水定容。在96孔板中加入50 L稀释液,依次加入50 L的FeSO4(现配现用)、50 L 的水杨酸-乙醇溶液、50 L 的 H2O2,37 反应30 min,然后于510 nm处测定吸光度(As);取 50 L 水代替稀释液测得空白吸光度(Ac),不加H2O2溶液为稀释液本底吸光度(Aj)。每个样品做4个平行,取其平均值。按公式(2)计算清除率。1.3.9还原能力测定参照 Liu Q 等15测定还原能力方法并稍作修改。吸光值越大,还原力越强。取100 L适当稀释的发酵液于2 mL 离心管,依次加入250
14、 L磷酸钠缓冲液和250 L 的 K3Fe(CN)6,50 水浴 20 min,加入 100 L的 TFA 终止反应,4 000 rmin-1离心 10 min。取上清100 L和去离子水混合,加入20 L的FeCl3室温孵育15 min,于700 nm下测定吸光度(A)。水代替发酵液作空白对照,以0.25 mgmL-1的VC作为阳性对照。2结果与分析2.1不同菌株的菌丝形态特征比较2.1.1菌丝生长情况由表1可知,不同黑皮鸡枞菌株在加富培养基上的菌丝长势存在差异,其中HP1、HP6、HP7、HP8的菌丝长势较强,菌丝粗壮浓密;HP2、HP3、HP4、HP5长势弱,菌丝纤细稀疏。同时不同黑皮鸡
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