DB21∕T 2628-2016 鱼类物种鉴定 PCR-RFLP 结合基因芯片分析法.pdf
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1、ICS 01.040.67 B 50/59 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 26282016 鱼类物种鉴定 PCR-RFLP 结合基因芯片 分析法 the identification of fish species the method of PCR - RFLP combined with gene chip 2016 - 05 - 09 发布 2016 - 07 - 09 实施辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 26282016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则第一部分标准的结构和编写给出的规则起草。 本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口
2、。 本标准起草单位:大连出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:闫平平、齐欣、田卓、崔妍、徐文英、刘莹、曲世超、尚宝玉、陈溪、黄大亮。 本标准系首次发布的地方标准。 DB21/T 26282016 1 鱼类物种鉴定 PCR-RFLP 结合基因芯片分析法 1 范围 本标准规定了远洋捕捞鱼类和沿海地区经济鱼类物种鉴定方法 PCR-RFLP 结合基因芯片分析法的技术规范要求。 本标准适用于鱼体肌肉组织,鱼糜及其鱼制品中鱼基因组的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)
3、适用于本文件。 GB/T 27025 检测和校准实验室能力的通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 物种 物种是生物分类学的基本单位, 也是生物繁殖的基本单元。 物种是互交繁殖的相同生物形成的自然群体,与其他相似群体在生殖上相互隔离,并在自然界占据一定的生态位。 3.2 PCR-RFLP polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性聚合酶链式反应 3.3 基因芯片 基因芯片也叫DNA芯片、DNA微振列
4、、寡核苷酸阵列。基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。 4 抽样与制样 将实验室样品粉碎,充分混匀后待用。 5 防污染措施 PCR检验过程的防污染措施应符合GB/T 27403的规定 6 原理 DB21/T 26282016 2 RFLP 是根据不同品种基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点直接发生了碱基的直接插入、缺失,导致酶切片段大小发生变化,这种变化可以通过特定探针杂交进行检测,从而可比较不同品种的 DNA 水平的差异,多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。PCR-RFLP 的基本
5、原理是 PCR 扩增目的 DNA 扩增产物在有特异性内切酶消化切割成不同大小片段,直接在基因芯片分析仪上分辨,不同等位基因的限制性酶切位点分布不同, 产生不同程度的 DNA 片段条带。 7 仪器设备 7.1 电子天平:感量 0.001g 7.2 台式离心机(最高转速 15000g),台式小型离心机 7.3 双温水浴锅(371、651) 7.4 漩涡振荡器 7.5 低温冰箱(2-8)、冷藏冷冻冰箱(-20) 7.6 荧光 PCR 仪; 7.7 高压灭菌锅 7.8 实时荧光 PCR 仪 7.9 芯片电泳仪(2100 生物分析仪)。 7.10 微量可调移液器及配套吸头 8 主要试剂 除另有规定外,
6、所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和Dnase的分析纯或生化试剂。 条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T 27025 的规定。 8.1 DNA 提取试剂盒 8.2 PCR-RFLP 鱼种鉴定试剂盒(包括 PCR 扩增试剂盒和限制性内切酶酶切试剂盒), 试剂盒内包括细胞色素 b 基因特异性片段扩增用 2PCR Master Mix、PrimerMix、dH2O、限制性内切酶 Dde I、HaeIII、NlaIII 及 Buffer 等。 8.3 DNA 1000 芯片试剂盒; 8.4 其他 PCR 相关制品均购自生物公司。 9 检测步骤 9.1 样品预处理
7、DB21/T 26282016 3 剪取样品 50 100 mg 大小的组织,混合均匀后捣碎后放入 1.5 mL 微量离心管 (Eppendorf)中待用。 9.2 基因组 DNA 提取 待用样品加入 20L 蛋白水解酶 K 和 200L 蛋白裂解缓冲液,混匀后 65孵育 10 min, 14000 g 离心 3 min, 取上清液,按照 DNA 提取试剂盒说明提取鱼基因组。最后将鱼基因组 DNA 溶于 30L 去离子水中(DNA 的质量浓度不低于 005 mg/L),于- 20保存。 可根据实际情况选择适宜的方法,对于一种动物可以提供几种常用的 DNA 提取方法,应允许其他提取方法的使用,提
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