DB21∕T 2628-2016 鱼类物种鉴定 PCR-RFLP 结合基因芯片分析法.pdf

ICS 01.040.67 B 50/59 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 26282016 鱼类物种鉴定 PCR-RFLP 结合基因芯片 分析法 the identification of fish species the method of PCR - RFLP combined with gene chip 2016 - 05 - 09 发布 2016 - 07 - 09 实施辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 26282016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则第一部分标准的结构和编写给出的规则起草。 本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：大连出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：闫平平、齐欣、田卓、崔妍、徐文英、刘莹、曲世超、尚宝玉、陈溪、黄大亮。 本标准系首次发布的地方标准。 DB21/T 26282016 1 鱼类物种鉴定 PCR-RFLP 结合基因芯片分析法 1 范围 本标准规定了远洋捕捞鱼类和沿海地区经济鱼类物种鉴定方法 PCR-RFLP 结合基因芯片分析法的技术规范要求。 本标准适用于鱼体肌肉组织，鱼糜及其鱼制品中鱼基因组的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 27025 检测和校准实验室能力的通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 物种 物种是生物分类学的基本单位， 也是生物繁殖的基本单元。 物种是互交繁殖的相同生物形成的自然群体，与其他相似群体在生殖上相互隔离，并在自然界占据一定的生态位。 3.2 PCR-RFLP polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性聚合酶链式反应 3.3 基因芯片 基因芯片也叫DNA芯片、DNA微振列、寡核苷酸阵列。基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。 4 抽样与制样 将实验室样品粉碎，充分混匀后待用。 5 防污染措施 PCR检验过程的防污染措施应符合GB/T 27403的规定 6 原理 DB21/T 26282016 2 RFLP 是根据不同品种基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点直接发生了碱基的直接插入、缺失，导致酶切片段大小发生变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种的 DNA 水平的差异，多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。PCR-RFLP 的基本原理是 PCR 扩增目的 DNA 扩增产物在有特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在基因芯片分析仪上分辨，不同等位基因的限制性酶切位点分布不同， 产生不同程度的 DNA 片段条带。 7 仪器设备 7.1 电子天平：感量 0.001g 7.2 台式离心机（最高转速 15000g），台式小型离心机 7.3 双温水浴锅（371、651） 7.4 漩涡振荡器 7.5 低温冰箱（2-8）、冷藏冷冻冰箱（-20） 7.6 荧光 PCR 仪; 7.7 高压灭菌锅 7.8 实时荧光 PCR 仪 7.9 芯片电泳仪(2100 生物分析仪)。 7.10 微量可调移液器及配套吸头 8 主要试剂 除另有规定外， 所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和Dnase的分析纯或生化试剂。 条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T 27025 的规定。 8.1 DNA 提取试剂盒 8.2 PCR-RFLP 鱼种鉴定试剂盒(包括 PCR 扩增试剂盒和限制性内切酶酶切试剂盒)， 试剂盒内包括细胞色素 b 基因特异性片段扩增用 2PCR Master Mix、PrimerMix、dH2O、限制性内切酶 Dde I、HaeIII、NlaIII 及 Buffer 等。 8.3 DNA 1000 芯片试剂盒； 8.4 其他 PCR 相关制品均购自生物公司。 9 检测步骤 9.1 样品预处理 DB21/T 26282016 3 剪取样品 50 100 mg 大小的组织，混合均匀后捣碎后放入 1.5 mL 微量离心管 (Eppendorf)中待用。 9.2 基因组 DNA 提取 待用样品加入 20L 蛋白水解酶 K 和 200L 蛋白裂解缓冲液,混匀后 65孵育 10 min, 14000 g 离心 3 min， 取上清液,按照 DNA 提取试剂盒说明提取鱼基因组。最后将鱼基因组 DNA 溶于 30L 去离子水中(DNA 的质量浓度不低于 005 mg/L)，于- 20保存。 可根据实际情况选择适宜的方法，对于一种动物可以提供几种常用的 DNA 提取方法，应允许其他提取方法的使用，提取的 DNA 应满足稳定获得 PCR 扩增产物要求。 9.3 目标 DNA 片段的 PCR 反应体系 PCR 反应体系见表 1，每个样品各做二个平行管。加样时应使样品 DNA 溶液完全落入反应液中，不要粘附于管壁上。在 25L 总体系中进行,其中包括模板 DNA1L。 表1 PCR 反应体 9.4 分析条件 PCR 反应条件按如下表 2 程序进行,预期扩增片段大小约为 464 bp。 表2 PCR 反应参数 Segment Number of Cycles Temperature Duration 1 1 95 5 minutes 95 30 seconds 50 30 sconds 2 40 72 30 seconds 3 1 72 7 minutes 注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整 9.5 限制性内切酶酶切： 将 25L PCR 产物分别与等量的 Dde、 Hae 和 Nla 3 种限制性内切酶混匀, 37 酶切 2 h,然后加入 1L 60 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA),混匀, 65 灭活内切酶 15 min。 Component Volume(1 Reaction) Volume(5 Reaction) dH2 O,sterile 9L 45L 2PCR Master Mix 12.5L 62.5L Primer M ix 2.5L 12.5L DB21/T 26282016 4 9.6 RFLP 分析： DNA 凝胶 ( gel)和 DNA 浓缩染料 ( dye)在室温下静置 30min， 按试剂盒说明将 DNA 凝胶与浓缩染料混匀(geldye), 2240 g 离心 15 min。依次在芯片相应孔中加入 9L 预染胶（geldye）、5L 阳性对照 (marker)、1L DNA 相对分子质量标准物( ladder)和 1L 样品 (酶切产物 )。在 Agilent2100芯片生物分析仪上分析酶切产物。 9.7 精密度试验 在重复条件下，获得多次试验结果的相对偏差即酶切数据大小不得超过产物大小的 5%。 10 结果处理与分析 对于 PCR 产物的 RFLP 酶切结果进行分析，选取的 Dde I、HaeIII 和 NlaIII 酶的酶切结果表现方式分为两种，图谱分析和数据分析。图谱可以显示出不同的条带，数据分析显示出酶切数据大小，进而对鱼种进行区分。 11 结果判断与表述 11.1 限制性内切酶酶切结果 样品PCR产物采用内切酶Dde I、HaeIII和 NlaIII酶切后，酶切片段与附录A中不同鱼种酶切片段进行比较。 11.2 结果表述 PCR扩增产物酶切比对结果为鱼种。 DB21/T 26282016 5 A A 附 录 A （资料性附录） 酶切片段比对 鱼种名 Dde酶 Hae 酶 Nla 酶 真鳕 209 247 47 109 331 94 104 286 狭鳕 209 240 74 105 248 103 287 黑线鳕 450 45 435 98 189 马哈鱼 119 354 438 99 192 无须鳕 466 110 330 129 360 小黄鱼 441 126 336 88 98 286 花鲈 88 115 261 141 315 438 蓝点马鲅 213 226 127 146 183 121 159 180 鲐鱼 211 224 127 326 89 103 274 棘头梅童鱼 446 130 330 91 103 285 许氏平鮋 146 295 134 323 103 362 长蛇鲻 475 44 106 322 84 105 303 鲬鱼 162 279 144 289 98 190 日本下鱵鱼 123 349 149 189 94 107 289 长吻红舌鳎 145 324 131 330 448 斑纹条鳎 165 279 135 290 473 方式云鳚 122 266 148 326 146 283 太平洋绒杜父鱼 456 148 330 148 285 黄尾鰤 123 264 436 127 164 191 绿鳍马面鲀 123 295 180 232 151 319 大菱鲆 123 295 135 150 189 488 日本笠鳚 123 350 85 97 179 104 288 牙鲆 145 240 96 135 103 373 大泷六线鱼 454 92 150 238 103 376 斑尾复鰕虎鱼 487 107 322 94 122 164 石鲽 146 283 137 238 92 106 295 木叶鲽 189 243 134 159 91 107 206 粗壮拟庸鲽 146 267 137 294 93 106 290 黄盖鲽 122 332 108 127 192 125 350 亚洲箭齿鲽 96 148 217 133 344 108 378 星斑川鲽 187 277 135 293 92 105 289 DB21/T 26282016 6 鱼种名 Dde酶 Hae 酶 Nla 酶 马舌鲽 483 86 294 92 105 293 箭齿鲽鱼 96 148 216 133 342 108 378 平头鲽鱼 146 269 137 294 91 105 290 黄金鲽鱼 160 285 135 296 184 292 岩鲽 190 290 135 293 94 107 294 黄肚鲽鱼 145 305 138 294 92 106 197 庸鲽鱼 483 86 294 92 105 293 高眼鲽 157 274 131 290 87 101 290 钝吻黄盖鲽 156 305 427 90 104 287 _