甘肃蚤缀乙酸乙酯部位对肺纤维化小鼠肺组织的保护作用.pdf
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1、,():,(),():,:,():赵长青,徐列明 扶正化瘀制剂抗肝纤维化和治疗慢性肝病的临床疗效 上海医药,():;刘平,吴定中,刘成海,等 扶正化瘀中药复方促进大鼠肝纤维化逆转的配伍机理研究 上海中医药大学学报,():甘肃蚤缀乙酸乙酯部位对肺纤维化小鼠肺组织的保护作用朱梦莹,沈 娜,辛化伟,郝春香,刘艳霞,崔玉磊(临沂大学医学院,山东 临沂)收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目();中国博士后基金项目();山东省博士后创新人才支持计划项目();大学生创新创业项目()作者简介:朱梦莹(),女,研究方向为天然药物化学。:,:通信作者:崔玉磊(),男,博士,讲师,从事天然药物化学研究。:,:摘
2、要:目的 探究藏药甘肃蚤缀乙酸乙酯部位对肺纤维化小鼠肺组织的保护作用。方法将 只小鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(比菲尼酮)和乙酸乙酯部位低、中、高剂量组(、),每组 只(雌雄各半)。假手术组小鼠气管内缓慢滴入生理盐水溶液(约 ),其余各组小鼠气管内缓慢滴入等体积博来霉素(),建立肺纤维化动物模型。连续给药 后,观察小鼠肺组织病理变化,检测肺系数、羟脯氨酸水平,采用 法检测小鼠血清、水平和 活性,免疫荧光法检测肺组织 蛋白表达,法检测肺组织、蛋白表达。结果 假手术组小鼠肺泡壁纤细,间质无炎性细胞浸润和胶原沉积。与假手术组比较,模型组小鼠肺组织间质有明显炎性细胞浸润,肺泡壁增厚,肺泡腔塌
3、陷,胶原沉积明显,肺系数、肺泡炎症、肺纤维化评分升高();肺组织羟脯氨酸、水平升高(),活性降低();肺组织、蛋白表达升高(),蛋白表达降低()。与模型组比较,乙酸乙酯部位组小鼠肺组织炎性细胞浸润逐渐减轻,纤维化逐渐改善,胶原沉积减少,肺系数、肺泡炎症、肺纤维化评分降低();肺组织羟脯氨酸、水平降低(),活性升高();肺组织、蛋白表达降低(),蛋白表达升高(),且呈剂量依赖性。结论 甘肃蚤缀乙酸乙酯部位具有抗肺纤维化作用,并呈剂量依赖性,其作用机制可能与其抑制 和 信号通路以及激活 信号通路有关。关键词:甘肃蚤缀;乙酸乙酯部位;肺纤维化;炎症;氧化应激;中图分类号:文献标志码:文章编号:():
4、特发性肺纤维化(,)是以肌成纤维细胞异常活化、细胞外基质(,)过度沉积、肺瘢痕形成为特征的一种特殊弥漫性间质性肺病,预后差,患病率和死亡率逐年上升。据报道,诊断后的中位生存期仅 年,且 危重患者也伴随严重肺纤维化。目前,尚无疗效好且毒副作用小的药物或治疗手段。肺纤维化的发病机制虽未阐明,但研究表明氧化应激、炎症和纤维化是引发肺纤维化的关键途径,其中主要涉及、和 等信号通路。研究发现,是调控氧化应激的关键核转录因子,可入核并启动多种抗氧化基因转录翻译相关抗氧化蛋白,减轻机体损伤。信号通路对肌成纤维细胞的形成、细胞外基质的沉积均有重要影响。因此,开发可同时作用于以上多途径的新型抗肺纤维化药物有重要
5、意义。藏药甘肃蚤缀 为石竹科蚤缀属多年生的垫状草本植物,在藏族地区已广泛用于治疗间质性肺病。现代药理学研究表明,甘肃蚤缀具有良好的抗 年 月第 卷 第 期中 成 药 炎、抗氧化和免疫调节等作用。课题组前期实验证明甘肃蚤缀总提取物具有抗肺纤维化生物活性,为了进一步探寻其活性部位及分子作用机制,本实验对甘肃蚤缀乙酸乙酯部位的抗肺纤维化作用进行评价,并对其机制进行探究,以期为其进一步开发利用提供理论依据。材料 药物 甘肃蚤缀采自青海省西宁市达坂山,由中国科学院西北高原生物研究所梅丽娟研究员鉴定为石竹科蚤缀属甘肃蚤缀 ,药材标本(编号)存放于中科院西北高原生物研究所青藏高原博物馆内。新鲜甘肃蚤缀样品在
6、室温下阴干,粉碎成细粉并过筛,得到粉末。将干燥粉末()在 下用 倍量 乙醇提取 次,每次 ,萃取物经过减压浓缩至 ,然后分别用石油醚和乙酸乙酯等体积萃取 次,合并乙酸乙酯萃取液,减压浓缩成浸膏,冻干得乙酸乙酯部位,相当于生药的得率为 ,用 溶液配制成质量浓度为 的混悬液,备用。试剂,抗体(货号、,英国 公司);标记和辣根标记的二抗抗体(货号、,北京百普赛斯生物科技 股 份 有 限 公 司);注 射 用 盐 酸 博 来 霉 素(货 号,海正辉瑞制药有限公司);阳性药比菲尼酮(货号,北京谨明生物科技有限公司);氯化钠注射液(规格 瓶,批号,山东齐都药业有限公司);、试剂盒(货号、,北京索莱宝科技有
7、限公司);羟脯氨酸、和 试剂盒(货号、,上海酶联生物科技有限公司);和 染色试剂盒(货号、,北京索莱宝科技有限公司)。动物 只清洁级健康 小鼠,购于甘肃中医药大学 实验动物生产许可证号 (甘),雌雄各半,周龄,体质量 。饲养环境适宜,通风良好,昼夜节律,温度(),相对湿度 ,雌雄分养,每隔 更换 次垫料,颗粒饲料喂养,自由饮食、饮水,实验动物使用许可证号(甘)。实验动物适应 周后按照体质量随机分组进行实验。所有小鼠在实验前饥饿处理 ,实验操作均在上午 到下午 之间进行。在整个实验过程中所涉及的动物实验均得到了动物保护和使用机构的批准,并严格按照规定进行实验。方法 造模 采用气管滴入博来霉素溶液
8、的方法建立小鼠肺纤维化模型。小鼠用 水合氯醛麻醉固定后,沿颈正中切开 ,钝性分离至气管,用注射器经气管软骨环间隙向气管内缓慢注入博来霉素(,约 );假手术组则向气管内缓慢注入等体积生理盐水溶液,缝合切口并将每只小鼠直立进行左右缓慢晃动数秒,确保小鼠左右肺内药液均匀分布。手术后缝合皮肤,待动物自然清醒后将其置笼内常规饲养,并每日进行常规室内清洁消毒。分组及给药造模 周后,随机选取 只小鼠(雌雄各半),麻醉后脱颈处死,摘取肺组织,制作切片并观察病理情况来确定模型是否成功。将造模成功的小鼠分为模型组、阳性对照组(比菲尼酮)和乙酸乙酯部位低、中、高剂量组(、),每组 只(雌雄各半),分组完成后当天开始
9、给药,假手术组和模型组灌胃等量 水溶液,连续 。小鼠肺系数检测给药 后,将小鼠用 水合氯醛麻醉,称重取血后,平放于鼠板之上,用 酒精轻轻擦拭胸部和腹部的皮肤,用剪刀依次将剪开腹部和颈部,完整分离出双肺,用 将肺组织表面血迹洗净,吸干肺脏表面水分,立即称重,称取肺湿量,计算肺系数。和 染色观察肺组织病理学将右肺置于 多聚甲醛中固定约 ,经梯度乙醇脱水后,浸入 中于 冰箱中预冻 ,然后放入冷冻切片机冻台上冷冻(),制备切片(),按照试剂盒操作说明书分别进行 和 染色。镜下观察过程采用从低倍镜到高倍镜,从整体到局部,从宏观到微观的方法,并参照 分级标准判定肺泡炎和纤维化的程度,见表。表 肺泡炎症和肺
10、纤维化分级及评分标准(法)评分 分肺泡炎症肺纤维化无无轻度炎症,单核细胞浸润,肺泡间隔增宽,限于局部和近胸膜部位,面积小于全肺 ,肺泡结构正常轻度纤维化,胸膜近处有间质纤维化,面积小于全肺 ,整体肺泡结构开始紊乱。中度肺泡炎症,面积占全 ,近胸膜处较严重中度纤维化,局部纤维化,病变区域从胸膜延伸,面积占全肺 。肺泡炎大于 ,偶见肺泡内有单核细胞及出血造成的实变重度纤维化,出现大小不等的囊气腔,病变大于 。免疫荧光染色检测 蛋白表达肺组织切片浸于枸橼酸盐缓冲液(),加热到,持续 进行抗原修复,冷却至室温后,冲洗 次,加入 过氧化氢室温下静置 ,以阻断内源性的过氧化物酶,冲洗 次,滴加 室温封闭
11、,弃封闭液,分别加入一抗()孵育过夜,冲洗 次,室温孵育 标记的二抗(),染色 ,冲洗 次,然后经过梯度乙醇脱水后,二甲苯透化,封片后镜检。荧光显微镜拍摄时均采用统一曝光时间,蛋白相对表达量采用 软件进行定量分析。肺组织中羟脯氨酸水平检测 称取 小鼠左肺组织,加入 倍量预冷的生理盐水,冰浴匀浆,转移至离心 年 月第 卷 第 期中 成 药 管中备用。取 待测样本,加入 消化液,混匀后置于 水浴锅中孵育 ,过滤,滤液使用羟脯氨酸试剂盒定量检测羟脯氨酸的水平,用羟脯氨酸水平间接代表肺组织中胶原沉积水平。法检测小鼠血清炎症和氧化应激相关因子水平 小鼠摘眼球取血,室温放置 ,、离心 ,取上层血清,按照试
12、剂盒说明书采用 法检测炎症细胞因子(和)和氧化应激相关因子(和)水平。法检测肺组织、和 蛋白表达 取于 保存的右肺组织,加液氮研磨,使用 裂解液裂解提取蛋白,、离心,取上清液即得总蛋白,试剂盒检测总蛋白浓度,加上样缓冲液于金属浴 变性 ,即得蛋白样本。蛋白上样,凝胶电泳后转移至膜,经封闭、孵一抗、二抗及显影,检测相关蛋白表达。统计学分析通过 软件进行处理,数据以()表示,组间比较采用单因素方差分析和 检验。为差异具有统计学意义。结果 甘肃蚤缀乙酸乙酯部位对肺纤维化小鼠肺组织病理变化的影响 如图 所示,染色结果表明,假手术组小鼠肺组织结构正常,肺泡间隔纤细,肺泡、气管形态正常,排列规律,未见炎性
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