多功能解磷真菌的筛选与解磷活性评价.pdf
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1、热带作物学报 2023,44(8):16621670 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2022-08-22;修回日期 2022-10-15 基金项目 国家重点研发计划项目(No.2020YFD10006000);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(No.1630042022010);海南省农业农村厅 2022 年农业种质资源保护项目(琼农计财202229 号)。作者简介 杨腊英(1981),女,博士,研究员,研究方向:微生物资源研究与利用。*通信作者(Corresponding author):黄俊生(HUANG Junsheng),E-mai
2、l:。多功能解磷真菌的筛选与解磷活性评价 杨腊英1,郭立佳1,周 游1,汪 军1,梁昌聪1,徐云龙2,黄俊生1*1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室,海南海口 571101;2.海南大学植物保护学院,海南海口 570228 摘 要:磷是植物生长发育过程中不可或缺的元素,但在田间大多以无效的结合态磷存在,土壤中的微生物能将无效态的磷转化为游离态的有效磷,充分提高磷的利用率。本研究采用平板溶磷圈法从玉米根围土壤中分离纯化出 1 株解磷真菌 XZY3PSF,对该菌株进行种类鉴定,分析该菌株在 125 d
3、内溶解 2.520.0 g/L 磷酸三钙的活性、10105个/mL孢子浓度下对磷酸三钙的解磷能力,及其在 035 d 内对 2.5、5.0 g/L 植酸钙的矿化能力,评价其与解淀粉芽孢杆菌及香蕉枯萎病病原菌间的相互作用。研究表明:基于形态特征结合 ITS 与-tubulin 基因序列,菌株 XZY3PSF 鉴定为Talaromyces purpureogenus;解磷菌在不同浓度的磷酸三钙下溶解出的有效磷含量均在 500570 mg/L 之间,培养基中的有效磷含量随着培养时间的延长而下降,第 13 天后高浓度磷酸三钙培养液中的有效磷含量降低幅度减弱,在第 25天时 15.0、20.0 g/L
4、磷酸三钙培养基中的有效磷含量极显著高于其他浓度;随着培养基中孢子浓度的增加,培养液中有效磷含量高峰值出现的时间越快,且其降低幅度随着孢子浓度的增加而扩大;在供试时间段内,随着培养时间的延长,菌株 XZY3PSF 对植酸钙的矿化能力越强;解磷菌 XZY3PSF、芽孢杆菌菌株 X5 均对香蕉枯萎病病原菌株 B2 具有拮抗作用,且解磷菌 XZY3PSF 与芽孢杆菌 X5 之间亦相互拮抗。研究结果可为研发解磷菌与拮抗菌的复合微生物菌肥奠定基础,同时,解磷菌 XZY3PSF 对植酸钙的矿化作用为后续研究其是否具降解有机磷类农药提供理论基础。关键词:解磷真菌;产紫篮状菌;磷酸三钙;植酸钙;拮抗作用 中图分
5、类号:S154.3 文献标识码:A Screening of a Multifunctional Phosphate-solubilizing Fugus and Eva-luation of the Phosphate-solubilizing Activity YANG Laying1,GUO Lijia1,ZHOU You1,WANG Jun1,LIANG Changcong1,XU Yunlong2,HUANG Junsheng1*1.Environment and Plant Protection Institute,Chinese Academy of Tropical Agric
6、ultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management of Tropical Crops,Ministry of Agriculture&Rural Affairs/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests,Haikou,Hainan,571101,China;2.School of Plant Protection,Hainan University,Haikou Hainan,570228,China A
7、bstract:Phosphorus is an indispensable element in the process of plant growth and development,but it is mostly in the form of ineffective bound phosphorus in the field.The microorganisms in soil can convert the ineffective phosphorus into free effective phosphorus,and fully improve the utilization r
8、ate of phosphorus.In this study,a phosphate-solubilizing fungus XZY3PSF was isolated and purified from the corn rhizosphere soil using the phosphorus-solubilized halo method,and the strain was identified.The activity of the strain to dissolve 2.5-20.0 g/L tricalcium phosphate and the phosphate solub
9、ilization ability of 10-105 spores/mL to tricalcium phosphate in 1-25 d were analyzed.The mineralization ability of 2.5 g/L and 5.0 g/L calcium phytate was evaluated,and the interaction between it and 第 8 期 杨腊英等:多功能解磷真菌的筛选与解磷活性评价 1663 Bacillus amyloliquefaciens and the pathogen of banana Fusarium wi
10、lt disease was evaluated.Based on the morphological characteristics combined with ITS and-tubulin gene sequences,the strain XZY3PSF was identified as Talaromyces purpureogenus.The highest content of available phosphorus dissolved by phosphate-solubilizing strain under different concentrations of tri
11、calcium phosphate was between 500 and 570 mg/L.The content of available phosphorus in the medium decreased with the prolongation of culture time.The decreasing range of the available phosphorus content in the tricalcium phosphate medium was weakened.On the 25th day,the available phosphorus content i
12、n the 15.0 and 20.0 g/L tricalcium phosphate medium was significantly higher than that of the other concentrations.With the increase of the spore concentration in the medium,higher peak value of the available phosphorus content in the culture medium appeared,and its decreasing range expanded with th
13、e increase of the spore concentration.During the test period,with the extension of culture time,the mineralization ability of XZY3PSF to calcium phytate was stronger.XZY3PSF and Bacillus X5 had antagonistic effects on the pathogen of banan Fusarium wilt,but the phosphate solubilizing fungus and Baci
14、llus spp.also antagonized each other.The research results would lay a foundation for the development of microbial fertilizers composed of phosphorus-solubilizing fungi and antagonistic bacteria.At the same time,the mineralization of XZY3PSF on calcium phytate would provide a basic theoretical basis
15、for subsequent studies on whether it can degrade organophosphorus pesticides.Keywords:phosphate-solubilizing fugus;Talaromyces purpureogenus;tricalcium phosphate;calcium phytate;antagonism DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2023.08.016 磷是作物生长发育所必需的三大营养元素之一,在植物的细胞分裂、能量转移、信号传导、核酸合成以及光合作用等过程中发挥着重要作用,也是农业生产中最
16、重要的养分限制因子。磷以磷肥的形式添加到土壤中,据统计,在我国,磷肥在土壤中的当季利用率一般只有 10%25%1,植物未利用的部分均转化成不溶的固定形式。在酸性土壤中,土壤中难溶性无机磷多被固定为磷酸铁、磷酸铝类化合物,在中性及石灰性土壤中则多被固定为磷酸三钙类化合物。因此,如何开发和利用被土壤固定的磷素,提高土壤中磷的有效利用率,减少化学磷肥的施用是我国可持续农业中必需解决的问题之一。调节土壤酸碱度、施用有机肥、土壤淹水处理、合理施用磷肥和利用解磷微生物活化土壤难溶性磷均为提高土壤磷素有效性的途径2,其中,利用解磷微生物来提高土壤磷素有效性不仅符合当下“化肥使用量零增长”的需求,而且可以减少
17、因磷肥的过量施用所造成的农业环境污染。微生物对磷矿粉等难溶性磷肥的增溶作用及其在农业中的应用正成为国内外研究人员广泛关注的研究热点。很多土壤微生物包括细菌、真菌和放线菌均可参与土壤难溶性磷的溶解、转化和迁移过程,通过酸化、螯合和交换反应,将土壤中被固定的不溶性磷酸盐变成可溶形式3-5,以利于植物的吸收,进而增加作物产量6-7。目前对解磷细菌的溶磷特性和机制已开展了大量研究,但解磷真菌的相关研究仍然较少,已报道的主要为曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)6-18、木霉属(Trichoderma)19-20、篮状菌属(Talaro-myces)19,21、枝孢属(Cl
18、adosporium)22、拟青霉属(Paecilomyces)23-24等,其他类群较少报道。解磷真菌与细菌相比,其产生有机酸的能力更强,部分种属的溶磷效率明显高于细菌8,且在传代培养过程中溶磷活性的稳定性也显著优于细菌10。因此,寻找更多有溶磷功能的真菌类群,可为增强土壤或肥料中磷的可利用性提供更多的菌种资源。笔者团队通过近 10 a 的研究,已研发出一系列用于防控香蕉枯萎病、根结线虫等土传病害的生物菌肥产品,为扩宽生物菌肥菌株的功效,将拮抗生防菌与提高肥效利用率的菌株相结合研发不同系列的微生物菌肥,既可提高作物抵御病虫害入侵的能力,又能提高磷的利用率,进而改善农产品品质。本研究采用无机磷
19、筛选培养基,从农田黑土中筛选出高效解磷菌株,定性分析该菌株的解磷能力与芽孢杆菌的相互作用,为后续利用该菌株进行新菌肥的研发与田间应用奠定基础。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试土壤 土壤样品采自西藏藏族自治区墨脱县背崩乡(291436N,95109E),土壤类型为黑土,采样点为玉米根周土壤。1.1.2 供试菌株 解磷对照菌株 LGJPJ、拮抗芽1664 热带作物学报 第 44 卷 孢杆菌菌株 X5、香蕉枯萎病病原菌菌株 B2 均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所微生物资源研究与利用研究组分离鉴定并保存。1.1.3 供试培养基 (1)简化版无机磷固体培养基:葡萄糖 10.0 g
20、,硫酸铵 2.0 g,磷酸三钙 5.0 g,琼脂 20.0 g,水 1000 mL,pH 7.007.50。(2)简化版蒙金娜固体培养基:葡萄糖10.0 g,硫酸铵 2.0 g,植酸钙 2.0 g,琼脂 20.0 g,水 1000 mL,pH 7.007.50。(3)简化版无机磷(有机磷)液体培养基:葡萄糖 10.0 g,硫酸铵 2.0 g,磷酸三钙 5.0 g(植酸钙 2.0 g),胰蛋白胨 0.5 g,去离子水 1000 mL,pH 7.007.50。(4)保存用 PDA 培养基:马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,琼脂 18 g,蒸馏水 1000 mL,自然 pH。(5)LB 培养基(
21、g/L):胰蛋白胨 10.0 g,氯化钠 10.0 g,酵母提取物 5.0 g。所有培养基均在121 条件下高压灭菌20 min。1.1.4 供试溶液 (1)钼酸盐溶液:13.00 g 钼酸铵(NH4)6Mo7O244H2O溶于 100 mL 蒸馏水,0.35 g 酒石酸锑钾(KSbC4H4O7H2O)溶于 100 mL蒸馏水。在不断搅拌的情况下把钼酸铵溶液徐徐加入到 300 mL 50%硫酸溶液中,然后加入酒石酸锑钾溶液混匀,于棕色瓶 4 保存。(2)10%抗坏血酸溶液:10 g 抗坏血酸溶于100 mL 的蒸馏水中,于棕色瓶 4 保存。(3)150 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠(pNPP
22、)溶液:称取 2.784 g pNPP 溶于 50 mL 蒸馏水中。1.2 方法 1.2.1 孢子接种液制备 挑取菌株的菌丝,放于PDA 平板中,28 恒温培养至长出孢子,用无菌水冲洗孢子并经无菌 3 层擦镜纸过滤后,即制备成真菌的孢子悬液,经镜检孢子数约为 7106个/mL。1.2.2 有效磷含量测定 吸取各处理的培养液2 mL 于 10 000 r/min 离心 10 min,参考陈玮25的钼锑抗比色法,测定上清液中的有效磷含量(使用光程 10 mm 的比色皿,波长采用 700 nm),以不接菌作为空白对照。以波长 700 nm 处吸光度值(OD700)为纵坐标(y),溶磷量(x)为横坐标
23、绘制磷标准曲线,得到钼锑抗磷标准曲线线性回归方程为:y=0.5031x+0.0112,相关系数 R2=0.9976,通过磷标准曲线回归方程计算溶液中的有效磷含量,以确定菌株的解磷能力。溶磷率计算公式为:溶磷率=(接菌有效磷含量对照有效磷含量)/加入无机磷源的量100%。1.2.3 解磷菌的筛选 (1)解磷菌的初筛。称取10 g 土壤样品置于 90 mL 无菌水中,28 摇床震荡 30 min 制成土壤悬液,土壤悬液梯度稀释至101、102后分别用玻璃棒涂布于无机磷固体培养基上,吹干后用封口膜封口并倒置于生化培养箱中 28 培养。通过观察平板上所长真菌菌落周围是否产生透明圈来初步筛选解磷菌,挑取
24、具有较明显透明圈的真菌菌落转接至 PDA 平板上进行纯化培养,并作为解磷真菌复筛的初筛菌株。(2)解磷菌的复筛。150 mL 三角瓶中装入无机磷液体培养基 50 mL,接入制备的孢子悬液200 L,于 28 180 r/min 震荡培养 5 d。解磷对照菌株 LGJPJ、芽孢杆菌 X5 从 LB 平板接种单菌落于 LB 液体培养基中,摇培 16 h 后,分别接种200 L 菌液至无机磷液体培养基中,于 37、180 r/min 摇床上培养 5 d,吸取各摇培液 2 mL 离心后取上清液,根据有效磷含量测定方法,对比各菌株培养液中有效磷浓度的大小,筛选出高效解磷菌。(3)解磷菌对有机磷的矿化能力
25、。挑取解磷菌株菌饼置于简化版蒙金娜固体培养基上,通过观察平板上所长真菌菌落周围是否产生透明圈,分别测定解磷菌菌落直径(d)和溶磷圈直径(D),计算可溶性指数(D/d),分析菌株对有机磷的矿化能力。同时向培养基平板上滴加 2 mL 150 mmol/L pNPP,覆盖溶磷圈,4 h 后观察显色结果,如有黄色产生则说明解磷菌分泌磷酸酶。1.2.4 解磷菌的鉴定 (1)真菌 DNA 的提取。将经单孢纯化菌株在 PDA 培养基中活化,再按照SDS 法26提取真菌 DNA,于20 保存。(2)ITS 基因序列扩增。用真菌通用引物 ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3)、ITS4(5-
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