DB22∕T 1828-2013 农产品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的多重 PCR 检测(吉林省).pdf
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1、ICS 67.050 X 04 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 18282013 农产品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的多重 PCR 检测 Detection of Salmonella,Shigella and Staphylococcus aureus in agricultural products by multiplex PCR method 2013-05-15 发布 2013-09-01 实施吉林省质量技术监督局 发 布 DB22/T 18282013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2001 给出的规则起草。本标
2、准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位:吉林省产品质量监督检验院、吉林农业大学。本标准主要起草人:邴炜、陈萍、史艳宇、李月红、任常菲、王秀娟、崔敬爱。DB22/T 18282013 1 农产品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的多重 PCR 检测 1 范围 本标准规定了农产品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌核酸的多重PCR检测方法。本标准适用于农产品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的快速筛选检测。本标准不适合仲裁检验。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的
3、修改单)适用于本文件。GB 4789.4 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB 4789.5 食品微生物学检验 志贺氏菌检验 GB 4789.10 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链式反应(PCR)技术的应用 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 多重聚合酶链式反应(多重 PCR)multiple polymerase chain reaction 多重 PCR 又称多重引物 PCR,是在同一 PCR 反应体系中加上两对以上引物,同时扩增出多个核酸
4、片段的 PCR 反应。4 缩略语 下列缩略语适用于本标准。invA 基因:侵袭蛋白基因(invasion protein A gene)nuc 基因:耐热核酸酶基因(thermo-stable nuclease gene)ipaH 基因:侵袭性质粒抗原基因(invasive plasmid antigen H gene)5 试剂 除特别说明以外,所用试剂为分析纯或生化试剂。DB22/T 18282013 2 5.1 水:应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。5.2 缓冲蛋白胨水(BPW):按 GB 4789.4 规定。5.3 7.5%氯化钠增菌肉汤:按 GB 4789.10 规定。5.4
5、 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素:按 GB 4789.5 规定。5.5 引物:见表 1。表表 1 引物序列引物序列 5.6 细菌基因组 DNA 提取试剂盒。5.7 10PCR 缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),200 mmol/L氯化钾,20 mmol/L 氯化镁。5.8 dNTP:dATP、dCTP、dGTP、dTTP。5.9 Taq DNA 聚合酶。5.10 分子量标记:100 bp DNA Marker。5.11 琼脂糖:电泳纯。5.12 溴化乙锭。5.13 50TAE 电泳缓冲液(储备液):称取 484 g Tris,量取 114 mL 冰醋酸,200 mL 0
6、.5 mol/L EDTA,溶于水中,定容至 2 L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成 1TAE 电泳缓冲液(工作液)。5.14 6加样缓冲液:30 mmol/L EDTA、36%(体积分数)甘油、0.05%(质量浓度)二甲苯腈蓝 FF、0.05%(质量浓度)溴酚蓝。5.15 阳性质控菌株:来源于正规菌种保藏机构的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌标准菌株。5.16 阴性质控菌株:来源于正规菌种保藏机构的任何非目标菌株。6 设备和材料 6.1 天平:感量 0.001 g。6.2 生物安全柜:AII 型。6.3 厌氧培养系统。致病菌名称 靶基因 上下游引物序列 产物长度/bp 终浓度/(mmol
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