电针对正常小鼠血清单胺类神经递质的影响.pdf
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1、上海针灸杂志 2023 年 11 月第 42 卷第 11 期 1215 文章编号:1005-0957(2023)11-1215-08 动物实验 电针对正常小鼠血清单胺类神经递质的影响 裴丽娟1,2,冯晨晨1,2,姚超2,叶子1,2,张衙楠1,2,孙栩秋1,王珂1,周嘉1(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海 200437;2.上海中医药大学,上海 201203)【摘要】目的 观察单次电针对小鼠血清中单胺类神经递质的影响。方法 30 只雄性 C57BL/6J 小鼠随机分为对照组和电针组,每组 15 只。电针组单次电针双侧足三里穴,对照组仅予电针组相同的束缚。采用高效液相色谱仪测定电针干
2、预前及干预后 1 h、2 h、4 h、8 h、24 h 血清中去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、多巴胺(dopamine,DA)及其代谢产物 3,4-二羟苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylaceticacid,DOPAC)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)及其代谢产物 5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)的含量。结果 干预前,两组血清各单胺类神经递质比较,差异无统计学意义(P0.05)。两组干预后 1 h、2 h、4 h 和 8 h血清 NE 含量较干预前降低(P0.05,P0.01
3、);电针组干预后 24 h 血清 NE 含量显著低于对照组和干预前(P0.01)。两组干预后血清 DA 含量和 DOPAC/DA 比值在各个时间点均降低(P0.05,P0.01),对照组干预后 2 h 血清 DOPAC 含量较干预前降低(P0.05),电针组干预后 4 h 和 8 h 血清 DOPAC 含量较干预前升高(P0.01);电针组干预后 2 h、4 h、8 h 和 24 h 血清 DA 含量高于对照组(P0.05,P0.01),DOPAC/DA 比值低于对照组(P0.01)。两组干预后各时间点血清 5-HT 含量均降低(P0.01),两组血清 5-HIAA 在各个时间点差异无统计学意
4、义(P0.05);对照组干预后 8 h 和 24 h 血清 5-HIAA/5-HT 比值较干预前降低(P0.05),电针组干预后 1 h、4 h 和 24 h血清 5-HIAA/5-HT 比值较干预前升高(P0.01);电针组干预后 2 h 和 4 h 血清 5-HT 含量低于对照组(P0.05),干预后 1 h、4 h、8 h 和 24 h 血清 5-HIAA/5-HT 比值高于对照组(P0.01,P0.05)。结论 单次电针可对生理状态下小鼠外周血血清单胺类神经递质的含量产生影响。【关键词】电针;穴,足三里;去甲肾上腺素;多巴胺;5-羟色胺;小鼠【中图分类号】R2-03 【文献标志码】A
5、DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2023.11.1215 Effect of electroacupuncture on serum monoamine neurotransmitters in normal mice PEI Lijuan1,2,FENG Chenchen1,2,YAO Chao2,YE Zi1,2,ZHANG Yanan1,2,SUN YuQiu1,WANG Ke1,ZHOU Jia1.1.Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affilia
6、ted to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200437,China;2.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China Abstract Objective To observe the effect of a single session of electroacupuncture on monoamine neurotransmitters in serum of mice.Method Thirt
7、y male C57BL/6J mice were randomly divided into the control group and the electroacupuncture group,15 mice in each group.In the electroacupuncture group,a single session of electroacupuncture was applied to bilateral Zusanli(ST 36),while the control group was treated with the same restraint as the e
8、lectroacupuncture group.High performance liquid chromatography was used to determine norepinephrine(NE)and dopamine(DA)and its metabolites phenylacetic acid 3,4-dihydroxyphenylaceticacid(DOPAC),基金项目:国家自然科学基金项目(82074163,81973940);上海市针灸临床医学研究中心(20MC1920500);上海市临床重点专科项目(shslczdzk04701)作者简介:裴丽娟(1995),女,
9、2021 级博士生,Email: 通信作者:王珂(1980),男,研究员,硕士生导师,Email: 周嘉(1964),男,教授,博士生导师,Email: 1216 Shanghai J Acu-mox,Nov 2023,Vol 42,No 11 5-hydroxytryptamine(5-HT)and its metabolite 5-hydroxyindole acetic acid(5-HIAA)in serum before and 1 h,2 h,4 h,8 h and 24 h after electroacupuncture intervention.Result Before t
10、he intervention,there was no significant difference in serum monoamine neurotransmitters between the two groups(P0.05).The serum NE content in the two groups at 1 h,2 h,4 h and 8 h after intervention was lower than that before intervention(P0.05,P0.01).The serum NE level in the electroacupuncture gr
11、oup at 24 h after intervention was significantly lower than that in the control group and before intervention(P0.01).After intervention,the serum DA content and DOPAC/DA ratio in the two groups were decreased at each time point(P0.05,P0.01).The serum DOPAC content of the control group at 2 h after i
12、ntervention was lower than that before intervention(P 0.05),and the serum DOPAC content in the electroacupuncture group at 4 h and 8 h after intervention was higher than that before intervention(P0.01).At 2 h,4 h,8 h and 24 h after intervention,the serum DA content in the electroacupuncture group wa
13、s higher than that in the control group(P0.05,P0.01),and the DOPAC/DA ratio was lower than that in the control group(P0.01).After intervention,the serum 5-HT content in the two groups were decreased at each time point(P0.01),while there was no significant difference in serum 5-HIAA in the two groups
14、 at each time point(P0.05).The serum 5-HIAA/5-HT ratio at 8 h and 24 h after intervention in the control group was lower than that before intervention(P0.05),and the serum 5-HIAA/5-HT ratio at 1 h,4 h and 24 h after intervention in the electroacupuncture group was higher than that before interventio
15、n(P0.01).The serum 5-HT content of the electroacupuncture group was lower than that of the control group at 2 h and 4 h after intervention(P0.05),and the serum 5-HIAA/5-HT ratio at 1 h,4 h,8 h and 24 h after intervention was higher in the electroacupuncture group than in the control group(P0.01,P0.0
16、5).Conclusion A single session of electroacupuncture can affect the content of serum monoamine neurotransmitters in peripheral blood of mice in physiological state.Key words Electroacupuncture;Acupoint,Zusanli(ST 36);Norepinephrine;Dopamine;5-hydroxytryptamine;Mice 针刺治疗疾病具有整体调节作用,并具有双向的特性1。针刺效应的产生被认
17、为与“神经-内分泌-免疫”网络途径密切相关,具有多环节、多靶向的特征2。其中,针刺效应的产生与神经系统密切相关,针刺通过刺激机体穴位引起神经传入纤维的冲动,针刺信号从外周上传至中枢神经系统后进行逐级整合和持续传递3,反馈下行调节机制,同时促发内分泌和免疫系统,协同发挥整体调控效应。在这个过程中针刺可引起不同层级神经递质活性和水平的变化4。由此可见,神经系统是促发针刺效应产生的必要条件和始动因素5。神经递质是神经元之间或神经元与效应器细胞之间传递信息的化学物质,也是针刺效应产生的物质基础之一。单胺类神经递质既参与腧穴局部针刺信号的启动以及针刺信息在中枢神经系统各个层级的传导和信息整合,又参与针刺
18、对机体各个系统器官活动的调节6。针刺是中医学治未病的重要手段之一,能发挥未病先防和已病防变的作用,如素问刺热:“肝热病者,左颊先赤病虽未发,见赤色者刺之,名曰治未病。”足三里是针灸临床防病治病和保健强身的要穴。足三里是足阳明胃经的合穴,“四总穴”之一,也是针灸聚英中“回阳九针”的穴位之一。古法新解会元针灸学 评价足三里为“此穴治病万端,有白术之强,有桂附之热,有参茸之功,有硝黄之力”。更有千金要方有“若要安,三里常不干”的论述。现代研究7-8表明,针灸刺激足三里可对机体“神经-内分泌-免疫”网络产生影响,“足三里”在机体不同状态下发挥双向调节效应,从而对机体的生理病理发挥广泛的调节作用。本课题
19、组前期研究9-11表明,单次电针足三里能对中枢神经系统各级中枢发挥广泛的调节作用。单胺类神经递质在中枢和外周均发挥广泛的生理学效应,也是针刺效应的介导者和发挥效应的物质基础。因此,本文通过研究正常小鼠接受电针足三里处理后不同时间节段血清中单胺类神经递质含量的变化,探索电针对正常机体外周神经递质的调节效应规律,以期部分解析针刺治未病的可能机制。上海针灸杂志 2023 年 11 月第 42 卷第 11 期 1217 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 SPF级健康雄性C57BL/6J小鼠30只,5周龄,体质量 2022 g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,合格证号 SCXK(沪)2017-
20、0005。动物饲养条件为室温2025,相对湿度 50%65%,每日 12 h 光照。实验小鼠自由饮水、普通饲料喂养。适应性饲养 1 周后,随机分为对照组和电针组,每组 15 只。实验过程中对待动物遵照国家科学技术部 2006 年颁布的 关于善待实验动物的指导性意见。1.2 主要试剂与仪器 所有化学物质均为 HPLC 级,采用超纯水系统生产超纯水(Milli-Pore,美国)。标准品盐酸去甲肾上腺素(norepinephrine hydrochloride,NE)、盐酸多巴胺(dopamine hydrochloride,DA)、3,4 二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylace
21、ticacid,DOPAC)、盐酸 5-羟 色 胺(5-hydroxytryptamine hydrochloride,5-HT)、5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)均购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。安捷伦 1200 系列神经递质分析仪(南京利尔实验仪器设备有限公司),高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分工司),低温冰箱(日本 SANYO 公司),电化学探测器(Antec SDC ECD,荷兰),LH 200 型韩氏电针仪(南京济生医疗科技有限公司),中研太和不锈钢针灸针(0.16 mm7 mm,天津亿朋医疗器械有限公司)。1.3
22、 电针 用特制的棉布束缚装置对小鼠进行束缚,留小鼠双下肢在布套外,在束缚的基础上选用 0.16 mm7 mm不锈钢针灸针,75%乙醇常规消毒后直刺双侧足三里。取穴方法参考 实验针灸学12,通过体表解剖标志的确定以及骨度分寸法进行取穴,取双侧足三里穴,足三里定位为膝关节腓骨小头向后 0.5 cm,在胫骨和腓骨之间,针刺深度 7 mm。前期预实验进行电针“神经-免疫”调控相关实验时候,摸索过不同频率、强度和刺激时间,发现电针频率 10 Hz,强度 2 mA,留针时间 30 min对神经递质和免疫均有较好的调节效应,因此采用上述电针参数。针刺刺入足三里后,接通电针仪,调节电针参数。对照组仅用特制的棉
23、布束缚装置束缚 30 min,不予电针。1.4 取材 实验前 3 d,对小鼠进行环境和人为操作适应性习惯训练。采血时间点分别为电针干预前 1 d 及电针干预后 1 h、2 h、4 h、8 h、24 h,眼眶取血。每只小鼠取 150200 L 血液,室温静置 1 h,3 000 r/min离心 15 min,将离心后的上清液转移至新的 0.5 mL EP管,再次 3 000 r/min 离心 15 min;从每个 EP 管中各吸取上清液 40 L。每组小鼠每 3 只小鼠血清混为一个样本。混样后的血清(120 L/管)加入 8.6 L 的高氯酸,室温静置 5 min,3 000 r/min 离心
24、15 min,用移液枪吸出上清(大约为 60 L/管血清),置于80 保存待测。1.5 指标检测 将所有试剂标准品分别用 0.1 mol/L 的高氯酸配成质量浓度为 1.0 mg/mL 的标准储备液,贮存于 4 冰箱内。分析时用 0.1 mol/L 的高氯酸稀释到所需浓度。采用高效液相色谱法测定 NE、DA、DOPAC、5-HIAA以及 5-HT 等神经递质在血清中的含量。流动相为水:甲醇为 90:10(含 0.74 mmol/L 辛烷磺酸钠、80 mmol/L二水合磷酸二氢钠、0.027 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠和 2 mmol/L 氯化钾),磷酸调 pH3.0,将样品的上清液注入到
25、C18 柱(2.2 m,2.1100 mm;赛默飞世尔科技)中,温度为 38。用流动相磷酸盐缓冲液磷酸氢二 钠90 mmol/L,柠 檬 酸50 mmol/L,原 硅 酸1.7 mmol/L,EDTA 0.05 mo/L,以 0.2 mL/min 的流量进行分离,检测单元设置为 700 mV,防护单元设置为750 mV,通过化学站(安捷伦科技)对数据进行收集和分析。通过与已知外部标准的比较,确定峰和相对浓度。NE、DA、DOPAC、5-HIAA 以及 5-HT 各分子的高效液相色谱图见图 1。1.6 统计学处理 运用 SPSS22.0 软件对所有数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数标
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