NY∕T 3642-2020 桃品种鉴定 SSR分子标记法(农业).pdf
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1、ICS 65.020.01 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准NY /T 3642-2020 桃品种鉴定SSR分子标记法Identification of peach cultivars using SSR markers method 2020-07 -27发布2020-1-01实施中华人民共和国农业农衬部发布NY /T 3642-2020 目次T而言. . n 1 11.陀1.2 规范性可1m文件3 术语和l定义4 主要仪器设备及试剂5 溶液配制 . 6 引物相关信息及使用.7 参!自品种及其使用8 操作程序.9 结果统I10 判定方法. .附录八(规范性附录)主要仪器设备及试剂附
2、录B(规范性附录)溶液配制附录C(规范性附录)核心引物名单及j芋3iIJ 附录O(资料性附录)核心引物相关信息 . 10 附录E(资料性附录)参照品种名单及来源-. . 14 I NY /1 3642-2020 11 本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC277)归口.本标准起草单位中国农业科学院郑州果树研究所.本标准主要起草人王力荣,1Jlr坷、朱更瑞、方伟超、自在同文、王新卫、关利平。NY /1 3642-2020 桃品种鉴定SSR分子标记法范围本标准规定了利用简单蓝sl.序列(Simplcscqucncc repcats,SSRl分子标记进行桃111:11ll鉴定的操作
3、程序、数据采集和判定方法。本标准适用于桃(Pru川spersica W描画画画温疆赢蕾慧副啤!LSSR指纹数据自J采i.!及品利t鉴定.2 规范性引用文件下页。凡是不注日NY/ T 2341 NY/T 2594 3 NY/T 3.1 核心引期的版本适用于木文件.扩蛤i片段时,校正噎稳脚飞主母雪场抖宽泛厅,4 见附录A.5 溶液配制见附录B。6 冒|物相关信息及使用引物名单及序列见附录C,号7 参照晶种及其使用参!品种的名称及其相关信息参见附录E.在进行符iJJ!IJ样品的等位变异检iJJ!tl时,应同时包括相应参!(!品种的PCR扩峭产物的检测。注1.同一名称不同来说的参照品种的某一位点上的等
4、位变异可能不相同,在使用其他来源的参照rfl,;f!ut,Jii与以参!i品种核对,确认无误后使川.注2对于附录D中未包街的等位变异,JiY.按本标刊c.h法,通过1lI!HlDNA分析仪与参照品利同时进行检测确定其大小.8 操作程序8. 1 样品制备每份样品中至少随机抽取3个单株,混合后用于鉴定分析。当一致性结果较差时,进行单独取样分析。NY /1 3642-2020 8. 2 DNA提取a) 称11k桃新鲜i;JJ嫩JI.I一片1.0 g,m元菌双蒸水f洗干净,装人2mL 11l O. 5 mm直径钢殊的离心包中,放入液氮1预冷,将预冷后的离心m放入高通盐组织研磨仪中进行冷冻liJf靡,4
5、5I-Iz研磨905,至粉末状后,依次加入400L在65C 71.浴中预热的2%CTA裂lfl缓冲液、40L-流基乙酶,充分挤匀;b) 离心管置于65C恒汩l71l:10 min,4C 12000 g J萄心10mil1j c) 轻轻地l吸收上消液,转入新离心管中,直u入1/10体积的3mol/L m!胶制溶液,2.5倍体积20C T到冷元水乙醉,将离心佼佼上下摇动305, -20CYfJ1, 30 min至能见到UDNA絮状物;f) 4C 12000 g离心2min,立Ufl倒掉上消液,加入800L75%乙邸,用手指轻弹笆尖,使DNA沉淀漂浮于液体中,rfftJ5 min j g) 4C 1
6、2 000 g 1萄心2min,弃上清液,再IJfI人800L75%的乙醉,重复活洗DNA2次,h) 将离心管置于超净工作台干;垛,风干约5minj 。1m入250Lo. 5XTE缓冲液,4C浴解DNA10 min;JU入lL10 mg/ mL J RNa5c A,涡旋混匀,置于37C温滔30min, lfif RNA; j) 再加l人等体积的级仿-异戊醉(24 1, V V),轻轻混匀,4C12000 g 离心10min; k) 轻轻地吸取上!f,转入新?再心管中,1m人1/10体积的目前阪钊洛液和12. 5倍体积-20C预冷的元水乙醉,颠倒混匀,-20Cj(f,fl30min; 1) 4
7、C 12 000 g 1萄心2min,沉淀用75%乙醉$l;2次-3次,室温下风干,浴于250L双蒸水,一20C保存、备用。注:以上为推荐的DNA提取方法,其他营养器官以及达到PCR扩增Effi主要求的DNA捉取为法均适川.8.3 PCR扩增8.3. 1 反应体系PCR反应体系为10L,lOXPCR buffer 1L,2.5 mmol/L dNTP o. 8L,5FAM荧光标记的正反向引物的混合物O.6L,DNA样011,(20ng/L-30 ng/L)1 ,.L,5 U Taq DNA聚合酶0.1IL,超纯水6.5L, 寻|物信息见附录C,8.3.2 反应程序95C预变性5min;95C变
8、性305,56C退火305,72C延伸305,共35个循环;4C保存备用。8.4 PCR产物检测8.4. 1 变性聚丙烯酿胶凝胶电泳(Iolyacrylamidegel electrophoresis. PAGE) 8. 4. 1. 1 清洗玻璃板i洗玻璃板,用去离子水川1守,后Wii干备用。用之前再用95%乙醉擦洗2遍,吸水纸擦干。在l主板上涂上0.5mL亲和l硅炕工作液,啊l f础的短板上涂0.5mL剥离破炕工作液。操作过程中防止2块玻璃板互相污染.8. 4. 1. 2 组装电泳板待玻璃板彻底干燥后,在两侧放好衬条灭1齐,月3固定夹JII紧两块玻璃板,剂Hl水平仪洲平。8. 4. 1.3
9、制胶在60mL 6% PAGE胶液中分别加入600L10%的过硫自主锁和60,.L TEMED,轻轻混匀后。4守玻璃模具倾斜,用注射器l吸取胶液缓慢诸如两破硝板之间的空隙,r自胶过程防止气泡产生。待j皮液充满玻璃NY /T 3642- 2020 板夹层后,将0.4.mm厚1t:鱼齿梳齿平齐端向里轻轻插入胶液约0.4cm,胶液在室温下聚合2h以上。l庭聚合后,放入电泳梢,凹型破硝紧贴电泳缓冲液中i,FH大号固定夹固定位两侧。在上下电泳棚内滋人lXTBE电泳缓冲液.ftf丑llJJ!J:板表面溢出的胶液,轻轻拔11梳子,用糟内的缓冲液反复冲洗点样孔,以除去可能存在的米聚合的聚丙烯毗胀和1气泡。8.
10、 4. 1. 4 电泳每一个加样孔点人变性后的2L-4L扩增产物和1fL 6 X Loading Buffcr棍合液,在胶板jJ.!j侧点人DNAMarkcr, I徐待测样品外,还应同时力fJ人参!l!品利t的扩纳产物。在50W- 60 Wm功率下电泳,使凝l投温度保持在约50C,电泳L5 h- 2. 0 hC电泳时间取决于扩增片段的大小liI刮),同时观察澳!Ii蓝电泳至胶板j成吉普位jTt即可。注具体1)率大小根据8.4. 1.5 银染a) I!洗i仅:Hi帘水擦洗2b) 染色c) 擦洗。i仅d) c) f) 8. 4. 2 DNA 8. 4.2. 1 9 结果统计9. 1 数据表示将待拟
11、IJ样品某一位点位置和布圳l片段大小,9. 3 毛细管电泳荧光检测20 min,然后用蒸a的96孔板94C变性3比较,根据参照品种的迁移使用DNA分析仪的片段分析软件,读:h每个位点每个样品的等位变异大小数据。通过使用53个参照品种中的适宜材料,消除不同批次或不同型号DNA分析仪之间可能存在的系统误差。比较参照IB利f的等位变异大小数据与附录D中的相应数据。两者的差数为系统误差的大小。从待由tl佯,iI,(fJ等位变异数据中去|徐该系统误差,获得的数据UIl为待训tl样本的等位变异大小。9. 4 结果记录纯合位点的基因型数据记录为X/X,杂合位点的基因型数据记录为X/Y,其中X、Y分别为该位点
12、上两个等位变异,小片段数据在前,大片段数据在后;缺失位点基|封型数据记录为0/0,示例1.一个品种的一个SSR位点为纯合,等位变异大小为120忡,则该品种在该位点上的等位变异数据记录为120;120, 3 NY/T 3642-2020 示例2,一个品种的一个SSR位点为杂合位点.2个等位变异大小分别为140bp和1801币,则该品种在该位点上的等位变异数据记录为140;180.10 判定方法10. 1 结果判定用附录C中的10对号|物进行检测,获得待测样品和参照品种在这些位点的等位变异记录数据,每份样品的位点数目共20个,利用这些数w.进行比较,判定如下.a) 检测样品间的差异位点数二泣,判定
13、为不同样品b) 检测样品间的差异位数=1,!)11定为近似样品c) 检测样112间 的差异位点数=O,!)II定为疑问样品10.2 结果表述待狈样品一一一一与对照样品一一一一(或数据库中一一一一一已知品种)利JtJ一一一分子标记类型,采用一一一-一检测平台,采用一一一一一位点却l合进行检测,结果显示检测位点数为一一一一一一差异佼点数为一一一一一一声1I定为一一一一一一(不同或近似、疑问) 对于判定为疑同的情况,按照NY/T 2341的规定进行田间鉴定,以战终确定品种的异同。 A1 主要仪器设备A 1 1 高压灭菌锅A 1.2 电热恒温水槽A 1.3 A 1.4 电泳仪A 1. 5 A 1. 6
14、 A 1. 7 A 1. 8 A 1. 9 A 1 11 A 1. 12 A 1 13 A 2.1 A 2. 2 A23 A.24 浓盐酸A.25 氢氧化纳A. 2. 6 氯化纳A2.7 冰乙酸A. 2. 8 去离子7(A2.9 双蒸水A 2 10 仕琉基乙醇A 2 1 1苯l!llA 2 12 氯仿A 2.13 异戊醇A 2.14 醋酸纳A 2 15 无水乙醇A 2 16 琼脂糖A.2 17 核酸染料附录A(规范性附录)主要仪器设备及试剂ia噩噩噩喳F.-盟国hA 2. 18 DNA marker( 15000 bp) NY/T 3642-2020 5 NY /1 3642-2020 A.2
15、 19臭盼蓝A. 2. 20 二甲苯青A.2 21 甘油A. 2. 22 10 X PCR Buffer缓冲液(含Mg2+) A. 2. 23 4种脱氧核营酸(dNTPs)A.2 24 SSR引物A. 2. 25 laq DNA聚合酶A.2.26 去离子甲酷胶A. 2. 27 DNA分析仪用分子量内标(最大分子量500bp) A. 2. 28 DNA分析仪用光谱校准基质(包括HEX和ROX等荧光标记)A. 2. 29 DNA分析仪用电泳缓冲液6 . 1 1 mol/ L Tris溶液附录B(规范性附录)溶液自己制NY/T 3642- 2020 税、J1!1.121. 91 g Tris,溶解在
16、800mL去离子水中,待浴液冷却至室温后加入浓主)liJ节11-1至8.000力11水定容至1L,分装后高压灭菌备用。B. 2 0.5 mol/L EDTA溶液称I仅186.10 g二水EDTA,加入到800mL去离子水中,在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用氢氧化创调节溶液的pl-I至8.00,然后定容至1L,分装后高压灭菌备用。B. 3 2% CI础铀提缓冲溶液利、J1!1.CTAB4.00 g、氮化创刊.36g,jj)仅1mol/L Tris浴液20mL和10.5mol/L EDTA的液8mL,先用70mL双蒸水溶解,再定容至200mL ;:;EK灭tZI备用。B.4 3 mol/L醋酸纳溶液利、
17、Jj显40.81g三水醋酸俐,加入到80mL去离子水中游解,用冰乙酸调节pI-l至7.00,!JII水定容到100 mL,分装后高压灭菌备用。B.5 50XTAE缓冲液的配制称取Tris242 g和EDTA18.61 g于1L烧杯中,如l入约800mL去离子水,充分搅拌均匀,!Jn入57. 10 mL的冰乙酸,充分溶解,用氢氧化俐调pI-l至8.30,!J1I去离子水定容至1L后,室源保存。使用时稀释50倍.B. 6 1%琼脂糖凝胶的配制码;Jj!l.4 g琼脂糖.加入40mL l X T八E缓冲液,加热溶解后迅速倒入llitlJJll:袍中,待胶凝固后使用。B. 7 10 X Loading
18、 Buffer缓冲液称i仅I二DTA7. 33 g,澳盼蓝1.25 g、二可J苯背1.25 g,!JII入500mL烧杯中,加入约200mL去离子水,加热搅抖至充分溶解,!m入180mL甘训1,使用2mol/L氢氧化纳调节pI-l=7.00,用去离子水定容至500mL,.瓶保存备用。B. 8 SSR引物溶液合成的引物商心宫开荒前I革时离心105,按照说明书分别配制上游引物和l下游引物终浓度均为10mol/L,正反向引物等量混合,备用.B. 9 30%丙烯酷胶溶液(WjVl分别称取290g丙烯航!胶和10g rp叉双丙烯欧Jf!溶于约800mL水中,1JII水定容至1000mL,置于棕色瓶中OC
19、储存。8. 10 6%变性PAGE胶(年jVl盘Jli(16 mL 30%的丙烯酷!跤,12mL 5XTBE缓i11液、600L10%过硫股馁(新鲜配制)耳1160L四甲总乙二l跤,!JU水定容至60mL。8.11 亲和硅炕工作液l以Jli(1 mL无水乙醉,!JII入10L亲和破炕和10fL 冰酣酸,混匀。8. 12 剥离磕院工作液ilkJjit 2 mL的二甲基二氯硅锐,!m8 mL的三氮甲:院,混匀。7 /T 3642-2020 B. 13 10%过硫酸钱溶液(W/V)称i叙0.10g过硫股锁溶于1mL 71.中。B. 14 10XTBE缓冲液分别称取108g三经l:p基氨基rp炕和15
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