SN∕T 3486-2013 虾细菌性肝胰腺坏死病检疫技术规范(出入境检验检疫).pdf
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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 虾细菌性肝胰腺坏死病检疫技术规范犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狆 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 犳 狅 狉狀 犲 犮 狉 狅 狋 犻 狕 犻 狀 犵犺 犲 狆 犪 狋 狅 狆 犪 狀 犮 狉 犲 犪 狋 犻 狋 犻 狊狅 犳 狊 犺 狉 犻 犿 狆 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准虾细菌性肝胰腺坏死病检疫技术规范 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号( )北京市西城区三里河北街 号( )总编室: ( ) 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张
2、字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号: 定价 元书书书前言本标准按照 的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位: 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、 中华人民共和国山东出入境检验检疫局、 深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人: 郑晓聪、 王群、 何俊强、 史秀杰、 兰文升、 贾鹏、 王津津、 叶奕优、 王红英、 陈兵、 于力、刘荭。犛 犖犜 虾细菌性肝胰腺坏死病检疫技术规范范围本标准规定了虾细菌性肝胰腺坏死病的组织切片、 聚合酶链式反应和斑点杂交等方法。本标准适用于虾细菌性肝胰腺坏死病的流行病学调查、 诊断、 检疫和监测。规范性引用文件下列文
3、件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 出入境动物检疫采样疫病概述虾肝 胰 腺 坏 死 病 ( ; )是 由 肝 胰 腺 坏 死 性 细 菌 ( ; ) 引起的对虾疾病。肝胰腺坏死性细菌是一种革兰氏阴性菌, 大小约为 , 多形态, 专性细胞内寄生。( 参见附录)缩略语下列缩略语适用于本文件。 : 地高辛( ) : 虾细菌性肝胰腺坏死病( ) : 虾肝胰腺坏死性细菌( ) : 聚合酶链式反应( )试剂和材料 若非注明, 本标准所用生化试剂均为分析纯
4、的试剂。 若非注明, 实验用水应符合 一级水的规格。 甲醛。 冰醋酸。 石蜡。 二甲苯。 对苯二酚。 柠檬酸。 硝酸银。 乙醇。犛 犖犜 中性树胶。 蛋白酶。 饱和酚。 三氯甲烷。 异戊醇。 犜 犪 狇酶、 ( 含 、 、 、 ) 、 、 缓冲液( 不含 ) 和溴酚蓝等试剂可选用专业试剂公司提供的商品化试剂。 引物序列如下: : : : : 标准分子量: 推荐使用 。 琼脂糖。 产物纯化试剂盒。 地高辛( ) 标记试剂盒。 封闭剂( ) 。 碱性磷酸酶标记的 抗体。 四氮唑蓝( ) 。 溴 氯 吲哚磷酸甲苯胺盐( ) 。 二甲基甲酰胺() 。器材和设备 切片机。 显微镜。 水浴锅。 恒温箱。
5、纯水器。 普通冰箱和超低温冰箱。 台式离心机。 组织匀浆器。 扩增仪。 水平电泳仪。 微量移液器。 紫外观察灯或凝胶成像仪。临床症状 的症状包括摄食减少、 空肠、 软壳、 游动无力、 体表挂脏、 黑腮等对虾疾病的常见症状。典型症状表现为在泳足的基部发生溃烂或是黑化, 以及肝胰腺明显萎缩。感染对虾的肝胰腺萎缩后变得苍白,而正常的虾则为棕色或桔黄色。感染严重时, 肝胰腺腺管黑化, 外观上可见肝胰腺上形成黑色带。犛 犖犜 组织病理学检查 采样 按 的规定采样。 幼体取整体, 仔虾取头胸部, 幼虾和成虾取小块肝胰腺作为样品。 固定迅速将组织切成厚度不超过的组织块, 用 氏固定液( 见附录的 ) 固定以
6、上。根据组织块大小, 固定时间可适当调整, 或放置过夜, 期间按需要更换一次固定液。临床样品也可用 福尔马林固定, 长期保存。 切片固定好的组织块用水充分洗涤, 按下列程序处理: 乙醇( ) 乙醇( ) 乙醇( )无水乙醇( )无水乙醇( )二甲苯无水乙醇( 体积比) ( )二甲苯( )二甲苯( )二甲苯石蜡( 体积比) ( )石蜡( )石蜡( )石蜡包埋切片( 根据组织块大小和种类, 各步时间作适当调整) 。切片厚度最好不超过。 银染二甲苯( )二甲苯无水乙醇( 体积比) ( )无水乙醇( ) 乙醇( ) 乙醇( ) 乙醇( )蒸馏水( )浸入硝酸银溶液( 见 ) 中, 避光 , 在切片上滴
7、加显影液( 见 ) 使切片呈棕黄色( 数秒)用 蒸馏水冲洗( ) 乙醇( ) 乙醇( )无水乙醇( )无水乙醇( )二甲苯无水乙醇( 体积比) ( )二甲苯( )二甲苯( )中性树脂封片。 结果判断用显微镜观察到细胞质中出现病原微生物, 可初步判断为 , 确诊需要进行其他试验。犘 犆 犚检测 采样 按 的规定采样。宜取活或濒死的对虾作为样品。冷冻样品、 乙醇保存样品也可以用于 检测。 仔虾或稚虾, 取整只虾或虾头作样品。取虾头时, 用灭菌剪刀和镊子去除眼睛、 头胸甲、 所有的胸部附器和头部以后的腹部。 成虾, 取肝胰腺作为样品。 核酸提取 组织 提取也可采用等效的商品化 提取试剂盒, 按照说明
8、书进行操作。 把 取样的组织, 充分匀浆。 取 , 加入 消化缓冲液( 见附录 ) 温育。犛 犖犜 加蛋白酶至终浓度 , 上下颠倒混匀, 混合液置于 水浴, 水浴。 向匀浆液中按比例加入酚三氯甲烷异戊醇混合液( 见 ) , 上下颠倒混匀, 犵离心 。 转移上层水相, 加入等体积三氯甲烷异戊醇混合液( 见 ) , 上下颠倒混匀, 犵离心 。 转移上层水相, 加入倍体积的无水乙醇, 放置 以上。 犵离心 , 沉淀 , 倾去上清液。 于沉淀中加入 乙醇溶液 , 轻轻混匀后 犵离心 , 倾去上清液, 室温晾干。 用 灭菌双蒸水溶解 沉淀, 冰上保存备用。若需长期保存应放置在 保存备用。 犘 犆 犚扩增
9、 扩增体系在 管内, 加入 缓冲液( 不含 )、 的 、犜 犪 狇 聚合酶、 的引物 和引物 各、 、 模板 、 补充灭菌水至 。如使用无热盖的 扩增仪, 需在反应混合物上覆加 矿物油。混匀后低速离心, 让矿物油在上层。 扩增程序 预变性 ; 之后 变性 , 退火 , 延伸 , 共 个循环; 最后 补充延伸 ,保温。 设立对照取含有已知 的对虾组织抽提核酸作为阳性对照, 取无 的对虾组织抽提核酸作为阴性对照。取等体积的水代替模板作为空白对照。 琼脂糖电泳用 ( 见 ) 电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶( 含 , 见 ) 。将凝胶放入水平电泳槽, 使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将样品和溴酚蓝指示剂溶液按比
10、例混匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。 电泳约 , 当溴酚蓝到达底部时停止。 结果判断在 大小处, 阳性对照有扩增片段, 阴性对照、 空白对照没有扩增片段, 即阳性对照、 阴性对照、 空白对照均成立的条件下, 若样品在阳性对照处有扩增片段, 则判断为疑似阳性, 反之, 判断为阴性。 序列的测定 产物须通过序列测定来对检测结果进行最终确证, 序列参见附录的 。 核酸斑点杂交检测 采样 按 的规定采样。宜取活的或濒死的对虾作为样品。冷冻样品、 乙醇保存样品也犛 犖犜 可以用于斑点杂交检测。 仔虾或稚虾, 取整只虾或虾头作样品。取虾头时, 用灭菌剪刀和镊子去除眼睛、 头胸甲、
11、所有的胸部附器和头部以后的腹部。 成虾, 取肝胰腺作为样品。 地高辛标记探针的制备 体系在 反应体 系 中, 加 入 缓 冲 液( 不 含 ) , 的 , 犜 犪 狇 聚合酶, 的引物 和引物 各, , , 补充水至 。 程序 反应程序为: 预热 ; 之后 变性 , 退火 , 延伸 , 共 个循环; 最后 延伸 ,保存。 地高辛标记扩增产物片段大小为 , 序列参见 。用 产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化, 再利用地高辛标记试剂盒进行 标记, 得到地高辛标记的探针。 斑点杂交 将 取样的组织充分匀浆, 取 加入 消化缓冲液, 加蛋白酶至终浓度 , 上下颠倒混匀, 消化。 按样品数量以及阳性对照、
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