SC∕T 7223.4-2017 黏孢子虫病诊断规程 第4部分:吉陶单极虫(水产).pdf
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1、ICS 65.020.30 B 41 :才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7223.4-2017 黠抱子虫病诊断规程第4部分:吉陶单极虫Protocols for diagnosis of myxosporidiosis-Part 4: Disease caused by Thelohanellus kitauei 2017 -06- 12发布2017-10-01实施中华人民共和国农业部发布SC/T 7223.4-2017 目U昌SCj T 7223(黠抱子虫病诊断规程拟分为如下部分:一一第1部分:洪湖腆泡虫;一一第2部分:吴李腆泡虫;一一第3部分:武汉单极虫;一一第4部分:吉陶单极虫。
2、本部分为SCjT7223的第4部分。本部分按照GBjT1. 12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部渔业渔政管理局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会(SACjTC156)归口。本部分起草单位:中国科学院水生生物研究所。本部分主要起草人:李文祥、王桂堂、邹红、熊凡、吴山功、李明。I 范围黯抱子虫病诊断规程第4部分:吉陶单极虫本部分给出了鲤CCyprinuscar: lus kitauei)的采集、固定与本部分适用于鲤吉陶2 下列文件对件。凡是不注日GB/ T 66 SC/ T 71 3 3.1 3.2 3. 3 3
3、.4 3. 5 上游引下游引本对引3. 6 DNA 3. 7 其他试剂见4 仪器和设备4. 1 解剖盘、剪刀、慑子、4.2 体视显微镜和带测微标4. 3 盖玻片、载玻片和培养皿。4.4 电子天平。4. 5 普通台式离心机和高速冷冻离心机。4.6 普通冰箱。4. 7 微量移液器。4.8 PCR扩增仪。4. 9 离心管和PCR管。4. 10 紫外透射仪或凝胶成像系统。4. 11 水平电泳系统。SC/T 7223. 4-2017 ,规定了吉陶单极虫CThelohanel吉陶单极虫病的综合判定。l SC/T 7223. 4-2017 5 感染对象与临床症状5. 1 感染对象吉陶单极虫感染鲤。5.2 临
4、床症状吉陶单极虫寄生于鲤的肠道内,病鱼在池边独游,行动迟缓,不摄食,鱼体发黑消瘦;腹部稍隆起,肠道呈结节型膨大,形成瘤状;肠壁变薄,有腹水。6 吉陶单极虫的采集、固定与标本制作6. 1 病鱼采集观察待检鱼的临床症状和行为,采集具有典型症状的鱼,采样方法、样品数量、样品封存和运输应符合SC/T7103的规定。6. 2 样品的采集剖开腹部,剪开肠道的膨大处,用慑子取出包囊,置于培养皿中。6. 3 样品的固定用10%中性福尔马林溶液(见A.l)固定蒙古抱子虫包囊团或抱子,或用100%乙醇保存。6. 4 样晶的标本制作将蒙古抱子虫样品置于载玻片上,在标本中加一滴水,或者滴加少许吉姆萨溶液(见A.2),
5、盖上盖玻片,用于显微镜观察。7 吉陶单极虫的鉴定7.1 吉陶单极虫形态学鉴定根据显微镜内的测微标尺测量抱子和极囊的大小,吉陶单极虫抱子的形态特征见附录B。成熟抱子壳面观为长梨形,前端尖窄,近似圆锥体,后端钝圆,抱子外部具透明薄膜黯;抱子长23.0 m28. 0 m,宽7.9ml1. 0 m,厚8.3m10. 6m;极囊1个,形状与抱子相似,长度约为抱子长的3/5,极囊长13.0m18. 0 m,宽6.0m8.5m;薄膜黯长30.0m38. 0 m,宽12.0m17. 0 m;极丝盘成8圈10圈。如果抱子的形态特征与上述描述相符,则可判定为疑似吉陶单极虫。7. 2 吉陶单极虫分子检测7. 2.
6、1 虫体DNA的提取将用100%乙醇固定的抱子(有包囊的用清水冲洗,去除表面组织)充分干燥去除乙醇,置于1.5 mL 的离心管中,加人0.5mL裂解缓冲液(见A.6) ,55 oc下过夜。冷却至室温后,加人500LDNA抽提缓冲液(见A.7),摇匀,5200 g离心10min,收集上清液。然后加入O.1倍体积的乙酸铀缓冲液(见A. 3)和2倍上清液体积的200C预冷无水乙醇,40C下10000g离心10min弃上清液,用70%乙醇洗涤沉淀2次,弃上清液,空气干燥后溶于40LTE缓冲液(见A.的中,一200C保存备用。7. 2. 2 18S rDNA的PCR扩增在50L的PCR反应体系中,包含模
7、板基因组DNA10 ng50 ng、1.5 U Taq酶、1.5 mmol/L的MgClz、0.2mmol/L的dNTPs、上游引物和下游引物各2mol/L、Taq酶缓冲液5L。元加热盖的PCR仪应滴加少许矿物油。在PCR扩增仪中,950C预变性5min,再950C50 s560C 50 s720C 1 min,共35个循环;最后720C延伸10min。PCR扩增时,应设置阴性对照(无虫体DNA模板和阳性对照(含吉陶单极虫DNA模板)。2 SC/T 7223. 4-2017 7.2.3 PCR产物电泳与测序取5LPCR产物,加人1L澳酣蓝指示剂溶液(见A.10) ,混匀,用1.0%琼脂糖凝胶(
8、含0.05L/ mL GoldView核酸染料)于TAE缓冲溶液(见A.的中电泳分离,同时设置DNA分子量标准作参照,紫外透射仪下检查是否存在大约1600bp的目的条带。如存在目的条带,则取PCR扩增产物测序,其序列见附录C。7. 2. 4 结果判定将所测定的18SrDNA序列与附录C中的序列进行比对分析,如果相似性在99.0%及以上者,则判定为吉陶单极虫。8 综合判定8. 1 吉陶单极虫的判定如果薪抱子虫的形态鉴定符合7. 1的规定,且分子鉴定符合7.2. 4的规定,则判定为吉陶单极虫。8.2 吉陶单极虫病的判定鲤肠道感染的虫体为吉陶单极虫,且病鱼临床症状符合5.2描述,则诊断为吉陶单极虫病
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