SN∕T 3446-2012 澳大利亚植原体候选种检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf
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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3446-2012 澳大利亚植原体候选种检疫鉴定方法Detection and identification of Candidatus phytoplasma Australiense 2012-12-12发布2013-07-01实施中华人民共和同发布国家质量监督检验检疫总局N-ON|寸寸的问军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准澳大利亚植原体候选种检疫鉴定方法SN/T 3446-2012 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045) 总编室:(010)64275323兴网址WWW.s
2、pc. 且已 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴印张1字数20千字2013年7月第一次印刷1/16 2013年7月第一版印数1-1600 开本88012307巳定价18.00兴书号155066 2-25296 SN/T 3446-2012 SN/T 3446-2012 目。昌本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草O本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口O本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局O本标准主要起草人:牟海青、赵文军、张京宣、王仁睿、朱水芳、段胜男、王有福OSN/T 3446-2012 澳大利亚植原
3、体候选种检疫鉴定方法1 范围本标准规定了澳大利亚植原体候选种的检疫鉴定方法O本标准适用于澳大利亚植原体候选种寄主种苗中的澳大利亚植原体候选种的检疫和鉴定。2 原理2. 1 分类地位澳大利亚植原体候选手中Ccandidatusphytoplasma australiense),软壁菌门CTendericutes) ,柔膜菌纲(Mollicuteria) ,菌原体目(Mycoplasmatales) ,非醇原体科(Acholeplasmatacea叶,植原体候选属Ccandidatus phytoplasma) ,16SrX II组植原体。2.2 检测依据本标准主要采用形态生物学特性与分子生物学技
4、术相结合的方法对澳大利亚植原体候选种进行检测鉴定O对植物材料进行症状观察,发现有丛枝、黄化、红叶、卷曲等症状则进行进一步的检测;DAPI荧光染色方法可以作为一种初步检测植原体的方法;PCR技术结合RFLP技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法,在本标准中PCR技术与RFLP技术结合作为鉴定澳大利亚植原体候选种的准确方法;山f显微镜观察可以清晰、在观地观察到植出休粒体形态O3 器材与试剂3. 1 仪器PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机,台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、电子显微镜O3.2 试剂DAP
5、IC 4 ,6二脉基2苯基呵|睐)、PCR缓冲液、MgClz,dNTP、T叫DNA聚合酶、引物等。4 检测与鉴定方法4. 1 症状观察仔细观察种苗是否表现植原体侵染症状,症状描述参见附录A.104.2 DAPI染色选取幼嫩组织(新叶叶梗,枝梢,茎杆及根部韧皮部组织),切片,用1)J-gj mL DAPI溶液(4,6-二眯基2苯基呵|睐)染色,在460日m激发条件,荧光显微镜观察,在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号SN/T 3446-2012 表明有植原体存在O每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。4.3 电子显微镜观察将采集的样品制备超薄切片,通过电子显微镜观察植物韧皮部是否存在植原体粒
6、体O方法参见附录Bo4.4 通用引物进行PCR扩增并测序通用引物PCR凝胶电泳并测序(见附录。o4.5 虚拟RFLP指纹图i昔检测见附录Do5 结果判定5. 1 表现症状与A.1. 1描述一致且4.2检测实验中DAPI染色观察结果显示蓝色荧光,可初步判定为澳大利亚植原体候选种,但需通过4.4、4.5任一方案进一步检测O5. 2 在4.3检测中,若通过电子显微镜观察,发现葡萄韧皮部筛管中含有直径为500nm 1 000 nm的圆形、椭圆形、不规则形状等的菌原体,则可初步判定为澳大利亚植原体候选种,但需要4.4、4.5任一方案的进一步检测。5.3 在4.4检测中,若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性
7、,可初步判定为澳大利亚植原体候选种,经序列测定并比对后,若与C.4中序列同源性大于97.5%,则可判定该样品携带澳大利亚植原体候选种。5.4在4.5检测rr ,将4.4检测rr测得的植!国体16SrDNA序列经17币r限制tl:内切酶进行虚拟晦切后,若酶切图谱与图D.1一致,则可判定该样品携带澳大利亚植原体候选种。6 样品保存与复核6. 1 样品保存与处理样品经登记和经于人签字后妥善保存O对检出澳大利亚植原体候选种的样品应保存于20 oC冰箱中,以备复核O该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理O6.2 结果记录与资料保存完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果
8、等,并要有实验人员和审核人员签字oPCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片O6. 3 复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责O主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性,必要时进行复核实验。2 SN/T 3446-2012 附录A(资料性附录)澳大利亚植原体候选种生物学特性A.1 澳大利亚植原体候选种A. 1. 1 表现症状由CaPa引起的葡萄黄化病在澳大利亚新南威尔士和维多利亚温暖地区的葡萄园中频繁发生。此外,CaPa还可以引起多种经济作物的严重病害:侵染葡萄时,引起葡萄黄化病,其症状和危害与葡萄金黄化病相似;佼染草莓时,引起草莓致死性茧化病,wJ.致;草莓fli死亡;佼染否水瓜时,
9、引起杏水瓜l页枯病,是毁灭性病害;侵染澳洲朱蕉时,引起澳洲朱蕉猝衰病;侵染新西兰亚麻时,引起新西兰亚麻黄叶病,是致死性病害O因此,经济影响十分重要OA. 1.2 寄主己失1日奇主包括葡萄(Vitisv川圳刊)、草莓(Frap,arinzassa)、番木瓜(Caricy)、澳洲未蕉(丁ordylineaustralis)、新西兰亚麻(Phormiumtena.T)、山亚麻(P.cookianum, (飞ro川robusta)、红三叶草(Tr扩liumratense)、稻瓜CCucum is m yriocrus)、笋瓜(Cucurb山maxima)南瓜cc.mos(机ta)、北美枫香(Liq川正
10、lambarstyracijlu川、桃(Pruusersl)和紫花百宿(Medic付M川va)、马铃薯(Slanurntuberusurn L)等OA. 1.3 传播介体叶蝉()liarus改isoi)、莞丝子(Cuscut)等OA. 1.4 地理分布以色列、澳大利亚、新西兰、玻利维亚;中国无报道OA. 1.5 形态学特性植!后体育牛伞j二植物|列皮部的筛特内,形态(见图A.l)大小约在500nml 000 nm,并能够通过细菌滤器,不具有细胞壁,呈现多型性,一般有球形、椭圆形、长杆形、梭形、带状和多态不规则形等多型性。由于生长周期不同,植原体呈现初生体、小球体、大球状体和丝状体等形态O图A.
11、1形态特征3 SN/T 3446-2012 A. 1.6 分子生物学信息环状基因组大小为879324hp,GC含量为27%,且含有一个3.7灿的质粒O基因组含有约839个阅读框(ORF),其中约500个编码蛋白的基因,337个基因编码假定的蛋白,以UGA为终止密码子。澳大利亚植原体候选种仅编码一个基因用于氧化磷酸化作用,仅编码一个基因用于甘油脂类代谢,缺失ATP合成途径、脂肪酸代谢途径以及二氧化碳固定功能。A.2 植原体细胞的富集A. 2.1 溶液配制植原体细胞富集缓冲液(100mL):元水KzHP041. 67 g,KH2P04 0.41 g,庶糖10g,牛血洁白蛋白O.15 g, PVP-
12、10 2 g,维生素CO. 53 g,用5mol/L的KOH调节p日值至7.60A. 2. 2 植原体细胞的富集方法称取新鲜样品叶中脉1.5 g,加入7mL8 mL新制备的提取缓冲液,50mg的石英砂,于研钵中研磨O冰上放置10min 15 min,加人5mL相同的缓冲液并摇晃均匀;将悬浊液转移至15mL离心管,5 000 r/min使用预冷的离心转头CBeckmanA20)4 oc离心5min,将上清液移至另一个离心管中,19 000 r/min离心20min,干燥沉淀并用60oc预热的2mL 2%CTAB溶液,重悬沉淀;60oc水浴中温浴,并不定期的JZdJO A.3 DNA提取A. 3.
13、1 溶液配制DNA提取缓冲液:2%CTABC50 oc左右溶解),1. 4 mol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,100 mmol/L Tris-HCl pH8。A. 3. 2 DNA 提取方法将1mL富集样品转移至2mL离心管,加入1mL DNA提取缓冲液;将离心管置于65oc水浴中温浴1h1.5h,每隔20min左右将离心管颠倒混匀;2 000 g ,4 oc离心2min;将离心后的上清液转移至一个新的离心管中,加入三氯甲炕/异戊醇(24/1)1 mL,混匀,形成乳浊液;将乳浊液在13000 g条件下,离心5mi川将上清液转入新管,加人800f1L预冷的异丙醇,15000 g
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