NY∕T 3166-2017 家蚕质型多角体病毒检测实时荧光定量PCR法(农业).pdf
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1、ICS 07.080 B 47 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3166一2017家蚕质型多角体病毒检测实时荧光定量PCR法Detection of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus-Real time PCR method 2017 -12-22发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出。本标准由全国桑蚕业标准化技术委员会归口(SAC/TC437)。NY/T 3166-2017 本标准起草单位:江苏科技大学、中国农业科学院蚕业研究所、农
2、业部蚕桑产业产品质量监督检验测试中心(镇江)、苏州大学、西南大学、华南农业大学。本标准主要起草人:吴萍、郭锡杰、陈涛、贡成良、潘敏慧、李龙、孙京臣。I NY/T 3166-2017 家蚕质型多角体病毒检测实时荧光定量PCR法1 范围本标准规定了家蚕质型多角体病毒CBombyxmori cytoplasrnic polyhedrosis virus)的实时荧光定量PCR检测方法。本标准适用于家蚕中肠组织中. 2 规范性引用文件3 缩略语4 原理5 试剂与设备5. 1 试剂与耗材除另有规定外,所用生用超纯水。提取RNA所用试剂酶污染。5.1. 1 RNA提取试剂。5. 1.2 一氯甲烧。5. 1.
3、 3 异丙醇。5. 1.4 75%乙醇。5.1.5 DEPC。5.1.6 cDNA合成试剂盒。5. 1.7 荧光定量PCR试剂盒。日期的版本适用于本文脱氧核糖核6682一级水要求并经灭菌或采配制,分装的容器应无RNA1 NY/T 3166-2017 5. 1.8 无RNA酶污染的枪头和离心管。5.2 主要仪器设备5.2. 1 实时荧光定量PCR仪。5.2.2 紫外分光光度计。5. 2. 3 高速冷冻离心机。5.2.4 -200C冰箱和-800C冰箱。5. 2. 5 组织研磨器或研钵。5. 2. 6 微量加样器。6 样晶的采集采集家蚕中肠组织(0.1 gO. 5 g)后迅速放人液氮中,再转移至一
4、800C冰箱保存。7 操作方法7. 1 RNA的提取7. 1. 1 将样品放人预冷的研钵中加人液氮,用研样将待检样品磨成粉末状(保持液氮不挥发干净),分装到元RNA酶的1.5mL离心管中,每0.1g组织加1.OmL RNA提取试剂,样品体积应小于Trizol体积的10%,振荡混匀,室温(200C300C)温育10min,12 000 g,40C离心10min。7. 1.2 将上清液转移到新的1.5mL离心管中,每1mL上清液中加人0.2mL三氯甲:皖0/5体积),剧烈摇动15s,室温放置5min,12 000 g,40C离心15min;混合物分层,卧-lA位于上层水相。7. 1.3 将上清液小
5、心转移到新的1.5 mL离心管中,加人等体积预冷的异丙醇(可在一200C冰箱放置20 rnin以上),颠倒混匀10次,室温静置10min, 12 000 g,40C离心10min,弃上清液,保留RNA沉淀。7. 1.4加入75%乙醇(DEPC7l配制),1.0mL RNA提取试剂加人1.0 mL 75%乙醇,轻轻混匀,7500 g,40C离心5min,弃上清液。7. 1.5 将RNA沉淀置于室温下自然风干5min 10 min,用30L40L的元RNA酶超纯水常温溶解RNA。7. 1.6 利用紫外分光光度计测定RNA溶液的光密度值。当A260/A280值为1.902. 05时,提取的RNA质量
6、符合PCR的检测要求。剩余RNA置于一800C冰箱保存备用。7.2 cDNA的合成以7.1中提取的RNA为模板,按照市售商品化试剂盒说明书反转录合成cDNA。以Takara公司生产的,货号为DRR047A试剂盒1)为例:首先进行去除基因组DNA反应,反应体系10L(反应液A),其中,5X gDNA Eraser Buffer 2L, gDNA Eraser 1L,RNA 500吨,补加元RNA酶超纯水至10L终体积。420C反应2min。然后进行反转录反应,反应体系20L,其中,5X Primer Script Buffer 4 L、PrimerScript RT Enzyrne Mix 1
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