NY∕T 3436-2019 柑橘属品种鉴定 SSR分子标记法(农业).pdf
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1、ICS 65.020.01 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3436一2019柑槽属晶种鉴定SSR分子标记法Identiflcation of Citrus varieties-SSR marker method 2019-01-17发布2019-09-01实施中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3436-2019 目次前言.n l 范围.12 规范性引用文件13 术语和定义.4 主要仪器设备及试剂.1 5 溶液配制.1 6 引物相关信息及使用7 参照品种及使用8 操作程序19 结果统计310 结果判定.3 附录A(规范性附录)主要仪器设备及试剂附录B(规范性附录)溶液配
2、制.7 附录规范性附录)核心引物名单及序列.附录D(规范性附录核心引物相关信息附录E(资料性附录)参照品种名单.mI NY /T 3436-2019 H 目U本标准按照GBjT 1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业农村部种业管理司提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SACjTC 277)归口。本标准起草单位:农业农村部科技发展中心、湖南农业大学、西南大学。本标准主要起草人:唐浩、李益、韩瑞笠、江东、邓超、马莹雪、李娜、邓子牛、赵艳杰。NY/ T 3436-2019 柑桶属品种鉴定SSR分子标记
3、法范围本标准规定了利用简单重复ff.:vtlCSimple sequcnce rcpcat, SSR)标记进行芸香科CRutaceae)柑楠周CCitrus L. )品种鉴定的操作程序、结果统计姑且机1日l本标准适用于柑桶屈品种SSR2 规范性引用文件件。凡是不注日期的寻G/ T 6682 NY/ T 2435 NY/ T 2594 3 术语和定义4 5 6 7 参照晶种及使用参!品种的名称参见附录E。产物。注多个品种在某一SSR位点上可能共有相同后,这些品种也可以代替附录D中的参照品利使用.B 操作程序8. 1 样晶准备每份样品取不少于3个单株的叶片或其他等效物,混合分析.8.2 DNA提取
4、应参!自品种的PCR扩增31利!位2,等位变异大小与参照品种相同夺混合后的样品放入液氮预冷的研钵中,加入液氮后迅速研磨时片多次至粉末状,JjJ.适盘粉末装入2mL离心管。每管JJII人1mLJ:il热C65C)rJiJ2% CTA提JtlI.液,充分混匀,65C恒ffit7K浴45min60 NY/T 3436一2019min,其间每隔10min颠倒混匀。于40C,12 000 r/min离心15mino取上清液至一新离心管,加入等体积的氯仿-异戊醇(24: 1, V : V),轻轻颠倒混匀,静置10min,于40C,12000 r/ min离心15mino取上清液至一新离心管,加入等体积预冷
5、的异丙醇,颠倒混匀,一200C下静置30min。于40C,12 000 r/ min 离心10min,弃上清液。70%乙醇洗涤DNA沉淀2次,风干,加入50L超纯水,加1LRNase(10 g/ L) ,37DC温浴30min;再加入等体积的氯仿-异戊蹲(24:1,V: V),于4DC,12 000 r/min离心15min;取上清液,加人等体积预冷的异丙醇,颠倒混匀,一20DC下静置30min; 12 000 r/ min常温离心15min,弃上清液。用70%乙醇浸泡洗涤DNA沉淀2次,风干,加入100L无菌水或TE缓冲液,通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量,一200C保
6、存。注:以上为推荐的DNA提取方法,所获DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法都适用于本标准.8.3 P扩增8.3.1 反应体系各组分终浓度如下:每种dNTPO. 20 mmol/L,正向、反向引物各0.25mol/L,Taq DNA聚合酶0.05 U/L,lXPCR缓冲液含Mg2+2. 5 mmol/ L) ,DNA溶液2.5ng/L,其余以超纯水补足至所需体积。利用毛细管电泳进行荧光检测时需使用荧光标记的引物。引物标记的荧光颜色见附录D。注:反应体系的体积可根据具体情况进行调整。可采用2X Taq PCR master Mix代替TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg2+。8.3
7、.2 反应程序940C预变性5min;94DC变性40s,600C退火40s, 720C延伸45s(可根据扩增片段的长度做出适当调整),共35个循环;72DC延伸10min,4DC保存。注:预变性和变性温度可以是940C或者9S0C,根据所使用的Mix的要求调整。8.4 PI产物检测8.4.1 变性聚丙烯酷胶凝胶电泳(PAGE)8.4. 1. 1 清洗玻璃板将玻璃板清洗干净,用双蒸水擦洗2遍,95%乙醇擦洗2遍。在带凹槽的短板上涂1mL剥离硅炕工作液,长板上涂1mL亲和硅烧工作液。操作过程中防止2块玻璃板交叉污染。8.4.1.2 组装电泳板待玻璃板彻底干燥后组装,在玻璃板两侧的前中后位置用夹子
8、固定,并用水平仪调平。8.4. 1. 3 灌胶在50mL 6.0% PAGE胶中分别加入350L10%的过硫酸钱和35LTEMED,迅速混匀后灌胶胶的体积根据玻璃板的面积及盗鱼齿梳子厚度进行调整。灌胶过程中防止出现气泡。待胶液充满玻璃板夹层,将1mm厚的造鱼齿梳子平齐端向里轻轻插人胶液约0.4cm。胶液在室温下聚合2h以上。胶聚合后,清理胶板表面溢出的胶液,轻轻拔出梳子,用水清洗干净备用。8.4. 1. 4 预电泳将玻璃板与电泳槽组装,在正极槽下槽中加入1XTBE缓冲液800mL,在负极槽(上槽)加入1XTBE缓冲液1000mL(缓冲液具体用量视电泳槽型号而定)05 V/cm预电泳10min.
9、20 min。8.4.1.5 变性在20LPCR产物中加入4L6X加样缓冲液,混匀。在PCR仪上950C变性5min,取出,迅速置于冰上,冷却10min以上。8.4.1.6 电泳用移液器清除凝胶顶端气泡和杂质。将整鱼齿梳子梳齿端插入凝胶1mm-.2 mm。每一个加样孔点入3L-.5L样品,在胶板一侧点入DNAMarker 0 5 V / cm条件下电泳,使凝胶温度保持在约NY/T 3436-2019 50C,电泳1h2 h(电泳时间J&决于扩增片段的大小范围).注:具体功率大小极据电泳梢的规格型号和l实验室室温设定.8 4. 1.7 银染a) 固定:将附有凝胶的玻璃板浸入固定液中,使固定液没过
10、凝!跤,在桥床上轻轻晃动5mil1; b) 以洗:取:H玻硝板,用双蒸水深洗30S; c) 染色将政硝板置于染色液中,使染色液没过凝!跤,在挤床上轻轻晃动2min.5 minj d) jl洗:用双蒸水快速漂洗,时间不超过30S; c) 显;彭将玻璃板置于在显t液中,) 定);将凝胶在固定液中定影g) rl洗用双蒸水!1M,:30 将胶板放在X9 结果统计样品的待测样品在9. 4 结果记录纯合位点的等位变异大小数据记为X/ x.JrII呗归赞惯:等位变异的大小,杂合位点的等位变异大小数据记录为X/Y,其中X、Y分别为该位点上的2个等位变异的大小,小片段数据在前、大片段数据在后。缺失位点的等位变异
11、大小数据记录为0/ 0.示曹IJ1:样品在某个位点上仪Hl现1个等位变异,大小为160bp,Ji1IJ该位点的等位变异数据记录为160;160.示19IJ2:样品在某个位点上有2个等位变异,分别为160bp.165 bp,j!tl该位点的等位变异数知日录为160/165.10 结果判定10 1 结果判定当样品间差异JL点数二泣,判定为不间当样品间差异位点数=l,!IJ定为近似飞当样品间差异位NY /T 3436-2019 点数=0,判定为极近似或相同。10.2 结果表述待测样品与对照样品或数据库中已知品种利用分子标记类型,采用检测平台,采用位点组合进行检测,结果显示:检测位点数为,差异位点数为
12、,判定为(相同或极近似、近似、不同。差异位点小于2个位点时,推荐按照NYjT2435的规定进行田间鉴定。4 NY / T 3436-2019 附录A(规范性附录)主要仪器设备及试剂A.1 主要仪器设备A. 1. 1 PCR扩增仪。A.12 ;:i压电泳仪:A. 1. 3 垂直也协1A. 1. 4 水平电f/JllA. 1. 5 A. 1.6 A.17 A 1.8 A 1.9 A. 1. 10 A 1. 11 A. 1. 12 A. 1. 13 A. 1. 14 A 1. 15 A 1. 16 A 117 A. 118 A 1. 19 A. 120 A.2 主要试剂除非另有说明,在分析中A. 2
13、.1 十六炕;lj=乙基澳化ii.!iCCT八)。A.22 聚乙烯11比l嗡炕闹CPVP) 。A.23 氯仿.A.24 异戊醉。A. 2. 5 异丙/IXoA. 2. 6 乙二股四乙酸二俐CEDTAl。A27 三资rp在氨基甲炕CTris)。A.28 浓盐般。5 NY/T 3436-2019 A.2.9 氢氧化锅。A.2. 10 10XBuffer缓冲液:含Mg2+25 mmol/ L。A.2. 11 4种脱氧核糖核昔酸:dATP、dTTP、dGTP、dCTP。A.2.12 氯化锅。A.2. 13 Taq DNA聚合酶。A.2.14 琼脂糖。A.2.15 DNA分子量标准:DNA片段分布范围至
14、少在50bp500 bpo A.2.16 核酸染色剂。A.2.17 去离子甲酷胶。A.2.18 澳盼蓝。A.2.19 二甲苯青。A. 2. 20 甲叉双丙烯酷胶。A.2.21 丙烯酷胶。A. 2. 22 硝酸。A. 2. 23 尿素。A.2.24 亲和硅烧。A. 2. 25 剥离硅烧。A.2.26 无水乙醇。A.2.27 四甲基乙二胶(TEMED)。A.2.28 过硫酸镀(APS)。A. 2. 29 冰醋酸。A. 2.30 硝酸银。A.2.31 甲睦。A.2.32 DNA分析仪用丙烯酷胶胶液。A.2.33 DNA分析仪用分子量内标Liz500。A.2.34 DNA分析仪用电泳缓冲液。A.2.3
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