SN∕T 5226-2019 出口食品中鳖源性成分的检测 实时荧光PCR方法(出入境检验检疫).pdf
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1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 52262019出口食品中鳖源性成分的检测 实时荧光PCR法Detection of Trionyx Sinensis ingredient in export foodReal-time rluorescent PCR method2019-12-27 发布2020-07-01 实施ICS 67.050C 53中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 52262019I前 言本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利
2、的责任。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国厦门海关。本标准主要起草人:苗丽、李想、张秀平、黄新新、郭德华、郑秋月、孔凡德、徐淑菲、黄世英、李志娟。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 52262019出口食品中鳖源性成分的检测 实时荧光 PCR 法1 范围本标准规定了出口食品中鳖源性成分的实时荧光 PCR 检测方法。本标准仅适用于食品中中华鳖、黄沙鳖、黑鳖、珍珠鳖、山瑞鳖、刺鳖、小鳖、印度小头鳖和缅甸缘板鳖等鳖成分的定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可
3、少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室 生物安全通用要求GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 鳖 Trionyx Sinensis是爬行纲龟鳖目鳖科鳖亚科的一类水陆两栖爬行动物。其肉营养丰富,是滋补佳品,同时鳖肉和鳖甲等也用作药材。3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction ;PCR模板基因序列先经高温变性成为单链,在 DNA
4、 聚合酶作用和适宜的反应条件下,根据模板序列设计的两条引物分别与模板 DNA 两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合,接着在 DNA 聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使引物得以延伸,然后不断重复变性、退火和延伸这一循环,使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。3.3 实时荧光 PCR real-time fluorescent PCR在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程。以正式出版文本为准2SN/T 522620193.4 Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语下列缩
5、略语适用于本文件。DNA :deoxyribonuleic acid,脱氧核糖核酸。PCR :polymerase chain reaction,聚合酶链式反应。dNTP :deoxyribonuleoside triphosphate,脱氧核苷酸三磷酸。dATP :deoxyadenosine triphosphate,脱氧腺苷三磷酸。dCTP :deoxycytidine triphosphate,脱氧胞苷三磷酸。dGTP :deoxyguanosine triphosphate,脱氧鸟苷三磷酸。dTTP :deoxythymidine triphosphate,脱氧胸苷三磷酸。Tris
6、:Tris(Hydroxymethyl)aminomethane,三羟甲基氨基甲烷。EDTA :Ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸。Taq :Thermus aquaticus,水生栖热菌。OD :optical density,光度密度。FAM :Carboxyfluorescein,羧基荧光素。BHQ1 :Black hole quencher 1,黑洞猝灭基团 1。5 方法提要样品经研磨后,提取 DNA,以 DNA 为模板,采用鳖线粒体细胞色素 b 基因的特异性检测引物和探针,进行实时荧光 PCR 扩增,观察实时荧光 PCR 的增幅现象,判断样
7、品中是否存在鳖成分。6 试剂和材料除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。6.1 检测用引物和探针鳖成分扩增引物和探针详见表 1。鳖引物扩增的靶标序列见附录 A。表 1鳖成分扩增引物和探针名称引物 / 探针序列(5 3)扩增片段长度靶基因鳖-FCCAYYTGATGAAACTTTGGATC157 bpcytochrome b鳖-RCGGATTAGTCAACCGTATTGTAC鳖-PFAM-TCACCAAAYATCTCYACAGCATTCTC-BHQ1 注:Y 代表碱基 C 或 T。以正式出版文本为准3SN/T
8、 522620196.2 试剂6.2.1 组织裂解液:1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) ;0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) ;10%(质量浓度)SDS。6.2.2 蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL) 。6.2.3 饱和酚。6.2.4 三氯甲烷。6.2.5 异戊醇。6.2.6 75% 乙醇。6.2.7 NaAc 溶液(3 mol/L) 。6.2.8 TE 缓冲液(Tris-HCl、EDTA 缓冲液) :10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0) ,1 mmol/L EDTA(pH 8.0) 。6.2.9 实时荧光 PCR 反应混合液:12.5 L 反应体系包括
9、 1U3 U 的 Taq 酶、1PCR 缓冲液、2.5 mmol/L 4.0 mmol/L 的 Mg2+、0.2 mmol/L 的 dNTP。如果具有等效的商品化试剂盒,也可使用这些等效产品。7 仪器和设备7.1 实时荧光 PCR 仪。7.2 离心机:离心速度不低于 12 000 r/min。7.3 恒温水浴锅。7.4 天平:感量 0.1 g、0.01 g。7.5 微量移液器:10 L、100 L 、200 L、1 000 L。7.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.7 涡旋振荡器。7.8 研钵及粉碎装置。7.9 pH 计。7.10 冰箱 2 8 、-20 。8 检验步骤8.1 DNA 提
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