毕业论文(设计)磁性纳米粒子的细胞内吞及基因转染研究.pdf
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1、上海交通大学博士学位论文摘要磁性纳米粒子的细胞内吞及基因转染研究摘要磁性纳米粒子(magnetic nanoparticles,MNPs)具有广阔的生物医学 应用前景,包括磁共振造影、细胞标记、药物/基因载体、肿瘤热疗等。磁性纳米粒子与细胞的相互作用研究是其生物医学应用的基础。近 年来,关于纳米粒子的细胞内吞研究取得了许多进展。然而,纳米粒子 的尺寸及表面电荷对内吞的影响尚存在广泛争议;相同的细胞对不同理 化性质的纳米材料的内吞存在着差异性;不同的应用目的对纳米粒子的 内吞的要求也不同;细胞对MNPs的内吞规律在体外和体内也存在较大 的差异。因此,本文从以下三方面进一步研究了细胞对MNPs的内
2、吞:i)人肺腺癌细胞SPC-A1对谷胱甘肽(家化型谷胱甘肽,Oxidized glutathione,GSSG)修饰的纳米磁粒MNPs-GSSG的生物相容性及内吞规 律研究。研究结果表明MNPs-GSSG生物相容性好,可被SPC-A1细胞高 效内吞,且在细胞内能长期滞留。SPCA1细胞对MNPs-GSSG的内吞是 需要能量的、浓度及时间依赖性的内吞。MNPs-GSSG粒子的安全性、细 胞内吞的高效性、在细胞内的长期滞留以及细胞内吞量的可控性,对于 磁共振造影、细胞标记以及热疗等生物医学应用都具有重要的意义。ii)SPC-A1及WI-38(人胚肺细胞)对氨基硅烷(y氨丙基三乙氧 基硅烷,y-Am
3、inopropyl triethoxysilane,APTES)修饰的纳米磁粒 MNPs-APTES的内吞量比较研究。两种细胞对MNPs-APTES的内吞量存 在巨大差异,且粒子在SPC-A1细胞中可长时间滞留。这对于癌细胞的体上海交通大学博士学位论文摘要内磁共振造影、细胞示踪及肿瘤热疗具有重要的意义。iii)SPCA1对MNPsGSSG,MNPsAPTES的内吞机制研究。结果 表明大小相似的两种粒子的内吞机制不同,这说明表面修饰比粒径大小 对内吞机制的影响要大。这提示我们可以通过改变MNPs表面修饰来改 变其内吞机制以适应不同的应用目的。近年来非病毒载体由于成本低、制作方便而发展迅速,然而,
4、如何 提高非病毒基因的转染效率仍然是基因转染的瓶颈。2002年出现并发展 起来的磁转染(Magnetofection)技术能够提高非病毒载体的转染效率。然而,MNPs与非病毒载体之间究竟采用何种方式构建转染载体才能有效 提高非病毒载体的转染效率,并没有统一的准则和指导思想。这部分归 因于磁转染的机理并不清楚,也就是说构建成的磁转染复合体各组分在 细胞内的命运及在转染过程中的作用需要进一步研究、阐释。本文比较了表面不同电荷特性的的MNPs的磁转染性能,发现不论 带正电性的聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)纳米磁粒MNPsPEL还 是带负电性的柠檬酸(citric acid,C
5、A)纳米磁粒MNPsCA、竣甲基葡聚 糖(carboxymethyldextran,CMD)纳米磁粒MNPsCMD,都可以和转染 载体(PEI或脂质体)及pDNA(质粒DNA,plasmidDNA)靠静电自组 装形成磁转染复合体(magneto也ctins)。静电自组装构建的磁转染复合 体能够提高PEI或脂质体的基因表达水平和/或阳性细胞表达率,且缩短 了转染时间。然而,磁转染效率具有细胞系依赖性,细胞类别不同,转 染效率差异较大。本文重点研究了磁转染复合体的各个组分在细胞内的途径、命运及 作用。通过多种分析表征研究发现,MNPs在转染中的作用为将转染复合 体拉到细胞表面,并且在进核之前与PE
6、I/pDNA复合体分离;本文证明上海交通大学博1:学位论文摘要自由PEI而不是包覆在MNPs上的PEI对转染起到重要的作用。本文提 出构建转染复合体的原则为:静电自组装的转染复合体中,MNPs与 PEI/pDNA复合体之间的结合力既要足够稳定能实现磁场力对转染复合 体的操纵,又要使得MNPs与PEI/pDNA复合体在细胞内容易分离。磁 转染机理的阐释及载体构建原则的提出,对于MNPs的表面修饰及磁转 染载体的构建具有指导意义。关键词:磁性纳米粒子,细胞相互作用,细胞内吞,基因转染,磁转染,胞饮作用,吞噬作用,表面修饰,生物医学应用Hi上海交通大学博士学位论文摘要Ma gnetic Na nop
7、a rticles:Cellula r Upta ke a nd Gene Tra nsfectionABSTRACTMagnetic nanoparticles(MNPs)are promising materials for various biomedical applications including MR imaging,stem cell tracking,gene/drug delivery and cancer treatment.Over the last decades,extensive research has focused on the interaction b
8、etween the MNPs with cells.However,the specific effects of MNPs size and surface charge are a controversial subject among different researchers.Within the same cell type and under different conditions,various MNPs formulations differing in surface modification may also use distinct endocytic machine
9、ries for internalization and intracellular routing pathways.To obtain additional knowledge on the internalization mechanism of MNPs into cells,three points about cellular uptake of MNPs have been evaluated as follows:i)Cytotoxicity and cellular uptake of oxidized glutathione(GSSG)modified MNPs(MNPs-
10、GSSG)in human lung adenocarcinoma cancer cells(SPC-A1).The results showed MNPs-GSSG were well biocompatible,could be efficiently taken up by SPC-A1 cells and the internalized MNPs-GSSG could retain in the cells for generations.The uptake of MNPs-GSSG into SPC-A1 cells was energy-,concentration-and t
11、ime-dependent.The controlled and efficient localization of MNPs-GSSG into the cytosol and their long intracellular retention provides theoretical and experimental insight into the biomedical applications.ii)The cellular uptake of APTES modified MNPs(MNPs-APTES)into SPC-A1 and human embryo lung cells
12、(WI-38).The results indicated the MNPs-APTES could be greatly taken up by SPC-A1 cells,but not by WI-38上海交通大学博士学位论文摘要cells,and the internalized MNPs-APTES could retain in the SPC-A1 cells fbr generations.This may be implied fbr the possible future application of MNPs-APTES in intracellular hyperther
13、mia,drug delivery system fbr lung cancer therapy or MRI for cell implantation.iii)The effects of surface modification of MNPs on internalization mechanism.The internalization mechanism of two kinds of similar size particles(MNPs-GSSG and MNPs-APTES)to SPC-A1 cells were different,which mean the surfa
14、ce modification was more crucial to internalization mechanism than the particle size.Therefore,we could monitor the internalization mechanism of MNPs by adjusting their surface modification.Research efforts are currently focused on non-viral vectors that exhibit biocompatibility and potential fbr la
15、rge-scale production.However,non-viral vectors exhibit significantly reduced transfection efficiency as they are hindered by numerous extra-and intracellular obstacles.Magnetofection could greatly improve the transfection efficiency of non-viral virus.However,the assembly methods of transfection com
16、plexes(magnetofectins)are a controversial subject among different researchers.This partly owns to the unclear magnetofection mechanism.Therefore,it is essential to elucidate the roles and the intracellular fates of the constituents of magnectofectins in magnetofection and to gain a fundamental under
17、standing on the design of magnetofectins.We prepared charged MNPs,polyethylenimine modified MNPs(MNPs-PEI),citric acid modified MNPs(MNPs-CA)andcarboxymethyldextran modified MNPs(MNPs-CMD).These charged MNPs could spontaneously form magnetofectins with plasmid DNA andPEI/liposome via electrostatic s
18、elf-assembly.These magnetofectins apparently enhanced PEI/liposome transfection efficiency and/or gene expression level into COS-7 cells with reduced transfection time from 4 h to 15 min under a magnetic field in vitro.Meanwhile,the effect of magnetofection was cell line-dependant.We investigated th
19、e mechanism of magnetofection using magnetofectins上海交通大学博士学位论文摘要that were prepared via electrostatic self-assembly of the three components:MNPs-PEI,pDNA and free PEI.Our results showed MNPs play the role of driving magnetofectins to the cell surface without entering into the nucleus.There was an opt
20、imal ratio of the constituents of magnectofectins to achieve optimal transfection efficiency by balancing stable complex formation and facile release of PEI/pDNA from the complex.Our findings further the knowledge of magnetofection and can be helpful for the design and preparation of gene delivery v
21、ehicles for effective magnetofection.Keywords:Ma gnetic na nopa ticles,Cellula r intera ction,Cellula r upta ke,Pinocytosis,Pha gocytosis,Surfa ce modifica tion,Ma gnetofection,Biomedica l a pplica tionvi上海交通大学博士学位论文目或目录中文摘要.i英文摘要.iv第一章绪论.11.1 细胞对纳米材料内吞的研究概述.11.1J细胞内吞的概念及分类./LL2研究细胞内吞纳米粒子的意义.3L1.3细胞
22、内吞纳米粒子的研究工具及方法.4LL4 影响纳米粒子内吞机制的因素.61.1.5纳米磁粒表面的不同修饰对细胞内吞的影响.81.L6细胞对纳米材料内吞的总结.121.2 非病毒载体基因转染的细胞曲碍及构建策略.13L2.1基因转染简介.13122基因转移的细胞障碍.141.2.3不同非病毒载体的特点及构建策略.17124非病毒载体构建的指导原则.221.3 基于P EI的磁转染的机理及研究概述.2313JPE1转染的特点.231.3.2 PEI/DNA转染复合体在细胞内的命运.24L3.3PEI在磁转染过程中的作用.251.4 本论文的研究目的、研究内容及创新性.27第二章SP CA1细胞对谷胱
23、甘肽修饰的纳米磁粒(MNP sP SSG)的内吞研究.292.1 实验部分.292.1.1 材料.29vii上海交通大学博士学位论文目玳2.1.2 MNPs-GSSG 的制备.302.1.3 MNPs-GSSG 的表征.302.1.4 MNPs GSSG的细胞毒性评价.302.1.5 MNPs-GSSG在SPUA1细胞内滞留量的定性分析.312.1.6 SPCA1细胞对MNPs-GSSG的内吞动力学研究.312.2 结果与讨论.322.2.1 MNPs-GSSG 的表征.322.2.2 MNPs-GSSG的细胞毒性评价.33223 MNP-GSSG在SPCA1细胞中滞留常的定性分析.342.2
24、.4 SPC-AI 对MNP$-GSSG 的内吞动力学.352.3 本章小结.37第三章SP CA1及W】38细胞对氨基硅烷纳米磁粒(MNP s-AP TES)的内吞研究.383.1 材料与方法.383.1.1 材料与设备.383.1.2 MNPs-APTES 的制备.383.13细.胞培养.393.1.4 两种细制在不同时间对磁粒内吞景的定量检测.393.1.5 TEM定性观察SPUA1与WI-38对MNPsAPTES的内吞.403.1.6 SEM观察SPC-A1及 初38细胞表面形态.403.1.7 用TEM观察MNPsAPTES在SPCA1细胞中的滞留.403.2 结果与讨论.403.3
25、 本章小结.43第四章SP C-A1对MNP s-GSSG及MNP s-AP TES内吞途径的研究.444.1 材料与方法.444.1.1 材料与表征仪器.444.1.2 MNPs-GSSG 及 MNPs-APTES 的制备及表征.45上海交通大学博士学位论文目录4.1.3 定量检测内吞抑制剂对SPCA1细胞内吞MNPs的影响.454.1.4 TEM观测内吞抑制剂对SPUA1细胞内吞MNPs的影响.454.1.5 TEM观测细胞对MNPs的内吞过程.454.2 结果与讨论.464.2.1 TEM 检泅MNPsGSSG 及 MNPs-APTES.464.2.2 内吞抑制剂对SPUA1细胞内吞MN
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