乙肝病毒标志物定量及其与E抗原血清学转换关系.pdf
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1、Hlllllllll Y2257688 _硕士学位论文乙肝病毒标志物定量及其与E抗原血清学转换关系 摘要研究背景:1965年,美国科学家Blumber g首次在澳大利亚土著人血清中发现“澳大利 亚抗原”。其随后被确定为乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B sur face antigen,HBsAg),是乙肝病毒(Hepatitis B Vir us,HBV)感染后最早出现于患者血清中的HBV标 志物。若HBsAg在患者血清中持续时间超过6个月,即可诊断为慢性乙型肝炎 病毒感染(Chr o nic hepatitis B,CHB)。据世界卫生组织WHO报道,全世界有3.5 亿左右慢性HBV
2、感染者,每年大约有100万人因HBV感染引起的并发症而死 亡。如肝硬化(Cir r o sis)、肝衰竭(Livergliur e)和原发性肝细胞癌(Hepato cellular Car cino ma,HCC)0因此,慢性乙型肝炎患者的管理与治疗是个艰巨而意义重大 的任务。乙肝病毒E抗原(Hepatitis B e antigen,HBeAg)与HBsAg同时或稍晚出现于 感染者血清中,是乙肝病毒在体内复制活跃的标志之一。在慢乙肝患者管理与 治疗过程中,若出现HBsAg或HBeAg消失,并产生表面抗体(Hepatitis B sur face antibo dy,HBsAb)或 E 抗体(
3、Hepatitis B e antibo dy,HBeAb),即发生血清学转换(Ser o co nver sio n)o通常意味着体内乙肝病毒复制活性降低,病情好转,是常用的 评估病情和治疗效果的指标,是重要的临床治疗终点。越来越多的临床研究发 现,治疗前血清HBsAg和HBeAg低水平与其高血清学转换率密切相关。I摘要随着检测技术的发展,定量检测HBsAg和HBeAg水平已成为可能。这为 我们深入探讨HBsAg和HBeAg水平及其变化模式评估HBV抗病毒疗效提供了 新手段。因此,我们需要能准确定量血清HBsAg和HBeAg水平的检测方法。目前,有两种试剂可以定量检测血清HBsAg水平,分别
4、是美国雅培公司和德国罗氏公 司的HBsAg检测方法。其中最为广泛使用的是雅培表面抗原检测方法。而罗氏 表面抗原检测方法可以通过简单的稀释步骤和转换实现HBsAg定量检测。Kar sten Wur stho m 和 Milan J.So nneveld等研究团 队已经对两种检测方法进行 比 较,发现二者之间的结果具有很高的相关性。但是其研究病例基因型分布以A 型和D型为主,而我国分布主要是C型和B型,故本研究第一部分比较雅培和 罗氏HBsAg检测方法定量检测基因型B和C患者血清HBsAg水平的相关性和 差异性。目前国际上尚无HBeAg定量检测试剂,但是雅培和罗氏HBeAg检测方法 都可以通过PE
5、IU标准品,制作标准曲线,然后实现定量检测血清HBeAg水平。雅培E抗原试剂每次更换批号时,需要重新制作标准曲线;而罗氏HBeAg试剂 可以直接使用由公司提供的定量转换公式,不受试剂批号影响。第二部分主要 比较雅培和罗氏HBeAg检测方法定量检测结果的一致性。乙肝病毒C基因区高度易变,常见变异位点G1896A变异和A1762T/G1764A 双变异。前者可使HBeAg翻译提前终止,而A1762T7G1764A双变异可明显降 低血清HBeAg水平。而血清HBeAg低水平者易于发生血清学转换。但是临床 实践中,我们亦观察到部分病例持续维持低水平E抗原,而不发生E抗原血清 学转换。我们推测,是否造成
6、HBeAg定量降低的原因的差异,导致其结果的不 同。因此,第三部分研究主要着重结合BCP/PC变异,观察E抗原定量水平对血 清学转换发生率的影响,从而提高HBeAg定量水平对抗病毒治疗疗效的评估预 测能力。研究目的:n硕士学位论文1.结合基因型及抗病毒治疗状态,比较罗氏与雅培试剂定量检测乙肝E抗原阳 性患者血清HBsAg和HBeAg水平的相关性与差异性。2.结合BCP/PC变异,观察血清HBeAg定量水平对HBeAg血清学转换发生率 的影响,从而提高HBeAg定量水平对抗病毒治疗疗效的评估预测能力。研究方法:1.比较雅培和罗氏试剂检测血清HBsAg和HBeAg水平的相关性与差异性1.1 研究样
7、本来源共收集1308例乙肝患者病例血清,均来自广州市南方医院肝病中心。所有 血清均同时接受雅培和罗氏两种表面抗原和E抗原方法检测,其中16份血清未 纳入定量分析比较,因两种或一种方法检测其E抗原为阴性。所有血清检测前 均被分装为成两份,保存于-30冰箱。1.2 雅培和罗氏检验方法1.2.1 HBsAg检测方法雅培HBsAg方法是化学发光微粒法,罗氏方法是电子化学发光微粒法。前 者是直接定量检测方法,而罗氏HBsAg方法需要通过简单的稀释步骤和转换实 现定量检测血清HBsAg水平。122 HBeAg检测方法雅培和罗氏HBeAg方法都是定性检测方法,但是通过PEIU标准品制作标 准曲线来定量检测血
8、清HBeAg水平。1.3 基因型测定对与乙肝病毒聚合酶逆转录区BC亚区部分重叠的表面抗原编码区进行直 接测序,然后进行系统树构建分型。1.4 统计分析所有结果在分析前均取10为底的对数值,两种方法的相关性比较使用 SPSS18.0统计软件进行Pear so n相关分析;连续变量的分组比较采用非参数方法 Mann-Whitney;两种方法差异性分析采用 Gr aphpad pr ism5.0 软件 Bl and-Altman摘要plo t进行描述。所有分析均采用双侧检验,若PV0.05,则认为有统计学意义。2.HBeAg定量与BCP/PC变异及其血清学转换关系研究2.1 病例来源患者来自南方医院
9、肝病中心参加“国家H一五重大专项“EFFORT临床研究的 受试者共83例。2.2 基因变异分析用 DNA抽提试剂盒(QIAamp DNA Blo o d Mini Kit)提取血清 HBV DNA,巢 氏PCR扩增C基因区并将第二轮产物送英骏公司进行直接测序。序列峰图用 Chr o mas软件分析,变异判断用Mutatio n sur veyo r软件3.0分析。23统计分析所有数据均使用SPSS18.0统计软件进行分析。分组间比较采用非参数 Mann-Whitney方法分析,多组间比较采用Kr uskal-Wallis H检验,率的比较用 Fisher精确检验分析,所有结果均采用双侧检验,P
10、0.05被认为差异有统计学意 义。HBVDNA和HBeAg在分析前取10为底的对数值。研究结果:L比较雅培和罗氏试剂检测血清HBsAg和HBeAg水平的相关性与差异性1.1 基因型分布与治疗状态根据直接测序及种系发生分析,血清总体基因型分布为:B基因型组:514 例(39.78%);C基因型组776例(60.06%),D基因型2例(0.16%)。核昔初治组 基因型分布为:B基因型442例(39.46%);C基因型676例(60.36%),D基因 型2例(0.18%)。根据治疗状态,分别有1120(86.69%)份未治疗患者血清纳入初 治组,172(13.31%)血清纳入治疗组。1.2 治疗前血
11、清HBsAg和HBeAg水平与基因分布关系治疗前表面抗原分布因基因型不同而有显著差异,基因型B组表面抗原定 量高于基因型 C 组(中位数 BC:4.53 VS 4.08 logio IU/mL,P=0.000,Z=-10.845);治疗前样本不同基因型E抗原定量的差异无统计学意义(中位数B:c:2.96 vs 2.88 lo gio PEI U/mL,P=0.203,Z=1.274)。硕士学位论文1.3 系统性比较雅培和罗氏HBsAg方法系统性比较,其相关系数是0.939(95%CI:0.932 0.945),P=0.000o 而其差异性为:lo g()IU/mL罗氏-lo gio IU/mL
12、 雅培=0.075 0.241 lo gio IU/mLo而两种检测方法定量检测HBeAg水平系统性比较,其相关 系数是 0.987(95%CI:0.985 0.988),P=0.000o 而其差异性为:lo gio PEIU/ml 罗 氏-lo g10PE IU/ml 雅培)=-0.149 0.165 lo gio PE lU/mL 1.4基因型分组比较根据基因型分成基因型B组和C组,两种HBsAg检测方法相关系数分别为 0.942(95%CE0.932 0.951)和 0.948(95%CI:0.940 0.955),P=0.000o 而其差异 性(比率(罗氏/雅培)分别为0.993和1.
13、037。两种HBeAg检测方法其相关系数 分别为 0.988(95%CI:0.985 0.990)和 0.986(95%CI:0.984 0.988),P=0.000o 而其差异性(比率(罗氏/雅培)分别为0.815和0.957。1.5治疗状态分组比较根据治疗状态,各基因型组分别被分为两组,B基因型组治疗前HBsAg相 关性为 0.919(95%CI:0.903 0.932),治疗后相关性为 0.979(95%CI:0.967 0.987),P=0.000o 而C基因型组治疗前HBsAg相关性为0.945(95%CI:0.936 0.952);治疗后相关性 0.956(95%CI:0.935
14、0.970),P=0.000o B 基因型组治疗 前 HBeAg相关性为0.985(95%CI:0.9810.987;治疗后HBeAg相关性为 0.980(95%CI:0.9680.988,P=0.000o而C基因型组治疗前HBeAg相关性为 0.984(95%CI:0.981 0.986);治疗后 HBeAg 相关性 0.982(95%CI:0.973 0.988),P=0.000o2.HBeAg定量与BCP/PC变异及其血清学转换关系研究2.1 治疗52周累积HBeAg血清学转换率与基线期HBeAg定量关系根据HBeAg水平是否大于2.44 lo g10PEIU/ml,分为HBeAg低定量
15、组和 HBeAg高定量组,其随访12周、24周、36周、52周时HBeAg血清学转换率 为 23.53%VS 0%(P=0.003),35.29%VS 1.92%(P=0.001),41.18%VS 5.77%(P=0.001),52.94%VS 17.31%(P=0.009).摘要2.2 BCP/PC变异与基线期E抗原定量关系研究变异组与野生株组E抗原定量水平有区别,有统计学意义(中位数变异组:野生组:2.69 VS 3.12 lo gio PEI U/ml,P=0.032);以 HBV DNA 校正后,同样有统计 学意义(P=0.003)。1762A/1764T纯合变异者E抗原定量中位数为
16、2.11 lo gio PEI U/ml,杂合变异者E抗原定量中位数为3.10 lo gio PEI U/mL野生株E抗原定量 中位数为3.08 lo g)o PEI U/ml,三组之间E抗原定量有统计学意义差别(P=0.002)。而杂合变异组与野生组之间差别无统计学意义(P=0.693)。以HBV DNA水平作 为校正因素,比较三组间区别,同样有统计学意义(P=0.006),而杂合变异组与 野生组之间无统计学意义(P=0.973)。2.3B CP/PC变异与治疔各期E抗原血清学转换率关系研究变异组与野生组随访12周、24周、36周、52周时HBeAg血清学转换率为 9.5%VS 0.0%(P
17、=0.150),9.5%VS ll.l%(P=1.00),9.5%VS 22.2%(P=0.173),23.8%VS 29.6%(P=0.589)o 研究结论:1.雅培与罗氏HBsAg方法和HBeAg方法定量检测结果均具有较高的相关性和低 差异性,且不受治疗状态和基因型影响。两种检测方法均可用于临床与科研定 量检测HBsAg和HBeAg水平。2.G1896A和/或A1762T/G1764A变异可明显降低血清HBeAg水平。3.血清HBeAg低定量水平时,发生HBeAg血清学转换的概率更高。4.治疗前G1896A和/或A1762T/G1764A变异与否与HBeAg血清学转换率无明 显相关性。关键
18、词表面抗原 乙肝病毒E抗原定量雅培罗氏血清学转换VI硕士学位论文Quantific atio n o f Hepatitis B Vir us mar ker s and their r el atio nship to Hepatitis B eAntigen Ser o c o nver sio n ABSTRACTBac kgr o und:Hepatitis B vir us(HBV)was fir stly r eco gnized by the disco ver y o f Austr alia antigen,in ser um by Blumber g in 1965.Sin
19、ce then,it has been used as the hallmar k fo r the diagno sis o f HBV infectio n and named as hepatitis B sur face antigen(HBsAg).It is the fir st mar ker appear ed in ser um o f patients infected with HBV.Its per sistence in ser um fo r mo r e than 6 mo nths is the key diagno stic cr iter io n fo r
20、 chr o nic Hepatitis B(CHB).Acco r ding to Wo r ld Health Or ganizatio n(WHO),ther e ar e mo r e than 350 millio n peo ple infected with HBV chr o nically.HBV infectio n acco unts fo r annually 1 millio n deaths wo r ldwide fr o m cir r ho sis,liver failur e,and hepato cellular car cino ma(HCC).So i
21、t is an impo r tant and difficult task to manage individuals with CHB.Hepatitis B e antigen(HBeAg)is ano ther HBV mar ker appear ed in ser um to gether o r later than HBsAg.Its existence in ser um means that vir us is pr o lifer ating actively.If HBsAg o r HBeAg disappear,and their co r r espo nding
22、 antibo dy can be detected,ser o lo gical co nver sio n(Ser o co nver sio n)happens.It usually indicates a decline in vir al r eplicatio n and the subsequent r emissio n o f liver disease,which is a favo r able clinical o utco me.So they ar e always used as mar ker s to evaluate antivir al ther apy.
23、Sever al differ ent tr eatment co ho r ts have sho wn that a lo wer pr etr eatment HBsAg and HBeAg level is asso ciated with a higher r ate o f their ser o co nver sio n.ABSTRACTWith the develo pment o f techno lo gy,it is po ssible to quantify HBsAg and HBeAg level.It is a new way to explo r e the
24、HBsAg and HBeAg level and their change patter n to evaluate antivir al ther apy.As a r esult,ther e is a gr o wing need fo r auto mated sample pr o cessing systems to pr o vide accur ate quantificatio n o f HBsAg and HBeAg in clinical pr actice.Cur r ently,ther e ar e two co mmer cialized assays tha
25、t can measur e the HBsAg quantificatio n,the Ar chitect HBsAg assay(Abbo tt Diagno stics)and the Elecsys HBsAg II assay(Ro che Diagno stics).The Ar chitect HBsAg assay is the mo st widely used assay fo r quantitative measur ement o f HBsAg.The Elecsys HBsAg assay can be utilized to quantify HBsAg th
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