DB63_T 1479-2016 青海草地早熟禾SSR分子标记鉴定技术规程(青海省).pdf
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1、TCS 65.020.20 B 21 备案号49251-2016DB63 主自海省由巳ETE,万标准DB63/T 1479一-2016青海草地早熟禾SSR分子标记鉴定技术规程2016-03-21发布2016-05-01实施青海省质量技术监督局发布目IJ1=1 本规程按照、GB!T1.1-2009给出的规则起草。本规程由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。本规程负责起草单位:中国科学院西北高原生物研究所。D863/T 1479-2016 本规程主要起草人:窦全文、赵闰闰、王海庆、汪新)11、喻风、李援、刘瑞娟、陈志、国、刘德梅。D863/T 1479-2016 青海草地早熟禾SSR分子标记鉴
2、定技术规程1 范围本规程规定了青海草地早熟禾品种真实性和纯度SSR分子标记鉴定的设备、试剂配制、操作程序、SSR号|物以及判定原则等技术内容。本规程适用于种子管理部门、农业科研、教学、生产、推广等单位对多年生牧草品种青海草地早熟禾真实性及纯度的鉴定。2 规范性亏|用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的号|用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB!T 3543.2农作物种子检验规程杆样3 缩回各语下列缩略i吾适用于本文件OSSR:简单重复序列DNA:脱氧核糖核酸dNTPs:四种脱氧核糖核昔酸PCR:聚合酶链式
3、反应4 仪器、设备与试剂仪器、设备与试剂见附录A。5.式开IJ自己制5.1 DNA 提取i式开IJ5.1.1 乙二肢四乙酸二纳盐(EDTA)溶液称职EDTA-Na2.2H209.306 g,力口去离子水35mL,剧烈搅拌,用NaOH颗粒o.80 g1.11 g调pH至8.0,定容至50mL,终浓度为0.5mol/L 5.1.2 三挂甲基氨基甲皖盐酸(Tri s-HC 1)溶液称职Tris6.060 g,力口超纯水40mL溶解,1商加j农HCl1.8 mL2.2 mL调pH至8.0,定容至50ml,终浓度为0.5mol/L。5.1.3 DNA t1)l液D863/T 1479-2016 称职十六
4、院基三甲基?臭化按(CTAB)8.0 g,氧化铀32.7 g,Tris-HCl盐酸溶液(0.5 mol/U 10 mL,EDTA溶液(0.5 mol/U 4此,混合,再用去离子水定容至400mL 5.1.4 三氯甲院和异戊醇混合液(24:1)量取三氯甲皖240mL和异戊醇10mL,昆匀此溶液配制在通风橱进行。5.1.5 70%乙醇5.1.6 10倍DNA溶解液Tris-HC溶液(0.5mo1/L)10 mL,EDTA溶液(0.5mol/U 2此,先加入到50mL去离子水中,溶解混合均匀,再走容至100mL,高温高压灭菌(121c,15分钟),室温保存。5.1.7 1倍DNA;容解液取10倍DN
5、A珞解液10mL,加入90mL去离子水,昆匀。5.2 PCR 扩增试剂5.2.1 dNTPs 混合溶液取浓度为100mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP储存液各25L混合,加入去离子水900L,配成终浓度为2.5mmol/L工作液。20c条件下保存。5.2.2 引物稀释用去离子水配制寻|物浓度为100州的储存液,取10L储存液加人90L去离子水配成10工作液。5.3 聚丙烯酿肢凝胶试剂5.3.1 5倍电泳缓冲液分别称取Tris54.0 g,棚酸27.5g,放于1000 mL烧杯中,加入蒸馆水800mL,充分搅拌溶解,再加入EDTA溶液(0.5mo1/L)20 mL,昆匀,定容至
6、1000 mL 5.3.2 30%丙烯酷肢分别称取丙烯酷肢29.0g和甲叉双丙烯酷肢1.0 g,并放于100日lL烧杯中,加入蒸馆水80mL,充分搅拌,定容至100mL,用滤纸过j虑,于棕色瓶中4c保存。5.3.3 10%过硫酸按称取过硫酸按0.100g,并放于1.5 mL离心管中。加入蒸馆水1mL,充分震荡,于4c冰箱保存,保存期不超过7天。5.3.4 1倍电泳缓冲液取5倍电泳缓冲液500mL,加去离子水2000 mL,混匀。5.3.5 加样缓冲液2 D863/T 1479-2016 称量EDTA0.440 g,臭酣蓝0.250g,二甲苯青0.025g,置于500mL烧杯中,向烧杯中加入去离
7、子水20mL,加热搅拌充分溶解,加入甘油18mL后,使用NaOH调节pH值至7.0,用去离子水定容至50mL,室温保存。5.4 染色试剂5.4.1 10mg/mL滇化乙链称量澳化乙皖0.50g,加入到200ml容器中,力加口入去离子水5印om1:将夺i溶窑割i液夜转移至棕色瓶中,室温避光保存。5.4.2疑胶染色液取10mg/mL漠化乙皖溶液10L,加入400mL的去离子水,昆匀。6 sl物SSR引物见附录Bo7 操作步骤7.1 试样制备青海草地早熟禾种子单粒发芽成苗。7.2 DNA t 是EJlDNA提取步骤如下:a)将DNA提取液在65oc水i谷中预热:b)剪取长度为5cm幼苗,置于2.0m
8、L的离心管中,加入2颗直径为o.5 cm的玻璃珠,在组织研磨仪上以频率为30次每秒研磨90秒:c)加入600L预热的DNA提取液,置于65oc水浴锅中,恒温30分钟,每5分钟颠倒泪匀一次。水浴后置于室温下冷却:d)加入600L三氯甲:皖/异戊醇混合液,混合均匀,置于20oc恒温摇床,震荡20分钟,室温下10000 r/m离心10分钟:e)小心吸取上层水相,置于新的1.5 mL的高,心管中,加入等体积的异丙醇,轻轻泪匀,置于20冰箱中冷冻4小时,小心勾取;票浮白 沉淀,置于1.5 mL的离心管中;f)加入500L70%的乙醇上下颠倒混匀5min,静置1mi口,吸取乙醇弃之,重复此操作2次:g)风
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