DB63_T 1479-2016 青海草地早熟禾SSR分子标记鉴定技术规程(青海省).pdf

TCS 65.020.20 B 21 备案号49251-2016DB63 主自海省由巳ETE,万标准DB63/T 1479一-2016青海草地早熟禾SSR分子标记鉴定技术规程2016-03-21发布2016-05-01实施青海省质量技术监督局发布目IJ1=1 本规程按照、GB!T1.1-2009给出的规则起草。本规程由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。本规程负责起草单位:中国科学院西北高原生物研究所。D863/T 1479-2016 本规程主要起草人:窦全文、赵闰闰、王海庆、汪新)11、喻风、李援、刘瑞娟、陈志、国、刘德梅。D863/T 1479-2016 青海草地早熟禾SSR分子标记鉴定技术规程1 范围本规程规定了青海草地早熟禾品种真实性和纯度SSR分子标记鉴定的设备、试剂配制、操作程序、SSR号|物以及判定原则等技术内容。本规程适用于种子管理部门、农业科研、教学、生产、推广等单位对多年生牧草品种青海草地早熟禾真实性及纯度的鉴定。2 规范性亏|用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的号|用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB!T 3543.2农作物种子检验规程杆样3 缩回各语下列缩略i吾适用于本文件OSSR:简单重复序列DNA:脱氧核糖核酸dNTPs:四种脱氧核糖核昔酸PCR:聚合酶链式反应4 仪器、设备与试剂仪器、设备与试剂见附录A。5.式开IJ自己制5.1 DNA 提取i式开IJ5.1.1 乙二肢四乙酸二纳盐(EDTA)溶液称职EDTA-Na2.2H209.306 g，力口去离子水35mL，剧烈搅拌，用NaOH颗粒o.80 g1.11 g调pH至8.0,定容至50mL，终浓度为0.5mol/L 5.1.2 三挂甲基氨基甲皖盐酸(Tri s-HC 1)溶液称职Tris6.060 g，力口超纯水40mL溶解，1商加j农HCl1.8 mL2.2 mL调pH至8.0，定容至50ml,终浓度为0.5mol/L。5.1.3 DNA t1)l液D863/T 1479-2016 称职十六院基三甲基?臭化按(CTAB)8.0 g，氧化铀32.7 g,Tris-HCl盐酸溶液(0.5 mol/U 10 mL,EDTA溶液(0.5 mol/U 4此，混合，再用去离子水定容至400mL 5.1.4 三氯甲院和异戊醇混合液(24:1)量取三氯甲皖240mL和异戊醇10mL,昆匀此溶液配制在通风橱进行。5.1.5 70%乙醇5.1.6 10倍DNA溶解液Tris-HC溶液(0.5mo1/L)10 mL,EDTA溶液(0.5mol/U 2此，先加入到50mL去离子水中，溶解混合均匀，再走容至100mL，高温高压灭菌(121c,15分钟)，室温保存。5.1.7 1倍DNA;容解液取10倍DNA珞解液10mL，加入90mL去离子水，昆匀。5.2 PCR 扩增试剂5.2.1 dNTPs 混合溶液取浓度为100mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP储存液各25L混合，加入去离子水900L，配成终浓度为2.5mmol/L工作液。20c条件下保存。5.2.2 引物稀释用去离子水配制寻|物浓度为100州的储存液，取10L储存液加人90L去离子水配成10工作液。5.3 聚丙烯酿肢凝胶试剂5.3.1 5倍电泳缓冲液分别称取Tris54.0 g，棚酸27.5g，放于1000 mL烧杯中，加入蒸馆水800mL，充分搅拌溶解，再加入EDTA溶液(0.5mo1/L)20 mL,昆匀，定容至1000 mL 5.3.2 30%丙烯酷肢分别称取丙烯酷肢29.0g和甲叉双丙烯酷肢1.0 g，并放于100日lL烧杯中，加入蒸馆水80mL，充分搅拌，定容至100mL，用滤纸过j虑，于棕色瓶中4c保存。5.3.3 10%过硫酸按称取过硫酸按0.100g，并放于1.5 mL离心管中。加入蒸馆水1mL，充分震荡，于4c冰箱保存，保存期不超过7天。5.3.4 1倍电泳缓冲液取5倍电泳缓冲液500mL，加去离子水2000 mL，混匀。5.3.5 加样缓冲液2 D863/T 1479-2016 称量EDTA0.440 g,臭酣蓝0.250g，二甲苯青0.025g，置于500mL烧杯中，向烧杯中加入去离子水20mL，加热搅拌充分溶解，加入甘油18mL后，使用NaOH调节pH值至7.0，用去离子水定容至50mL,室温保存。5.4 染色试剂5.4.1 10mg/mL滇化乙链称量澳化乙皖0.50g，加入到200ml容器中，力加口入去离子水5印om1:将夺i溶窑割i液夜转移至棕色瓶中，室温避光保存。5.4.2疑胶染色液取10mg/mL漠化乙皖溶液10L，加入400mL的去离子水，昆匀。6 sl物SSR引物见附录Bo7 操作步骤7.1 试样制备青海草地早熟禾种子单粒发芽成苗。7.2 DNA t 是EJlDNA提取步骤如下:a)将DNA提取液在65oc水i谷中预热:b)剪取长度为5cm幼苗，置于2.0mL的离心管中，加入2颗直径为o.5 cm的玻璃珠，在组织研磨仪上以频率为30次每秒研磨90秒:c)加入600L预热的DNA提取液，置于65oc水浴锅中，恒温30分钟，每5分钟颠倒泪匀一次。水浴后置于室温下冷却:d)加入600L三氯甲:皖/异戊醇混合液，混合均匀，置于20oc恒温摇床，震荡20分钟，室温下10000 r/m离心10分钟:e)小心吸取上层水相，置于新的1.5 mL的高，心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻泪匀，置于20冰箱中冷冻4小时，小心勾取;票浮白 沉淀，置于1.5 mL的离心管中;f)加入500L70%的乙醇上下颠倒混匀5min，静置1mi口，吸取乙醇弃之，重复此操作2次:g)风干白色沉淀，加入40L的1倍DNA溶解液，置于4oc冰箱，溶解24小时;h)用紫外分光光度计测定DNA溶液A2GO值、A2RO值，A2削/A2RO应在1.82.0之间O将DNA稀释到50口g/L100ng/L，置于20oc冰箱保存。7.3 PCR反应体系及程序7.3.1 PCR反应体系10 X PCR buffer 2.5L，2.5 mmol/L dNTPs 2.5L，样品DNA1L，10 11M SSR引物1L，Taq 酶(5U/L)0.3L，加去高于水利、足25L作为反应体系。3 D863/T 1479-2016 7.3.2 PCR反应程序PCR扩增程序如下，其中xOC为选用号|物的退火温度，见规范性附录B:a)94 oc预变性5分钟:b)94 oc变性30秒，x OC退火30秒，720C延伸30秒。此步骤进行35个循环:c)72 oC延伸10分钟:d)4 oC保存。7.4 聚丙烯酿肢凝胶电泳7.4.1 玻璃板处理用自来水将玻璃板冲洗干净，晾干，再用95%乙醇擦洗一遍，干燥。7.4.2 玻璃板组装玻璃板彻底干燥后，将两块玻璃板放入塑料胶条内，封装完毕后，用夹子固定在电泳槽上。7.4.3封口用1000L移液检将1%的琼脂糖沿胶条注入，凝固30分钟。7.4.4 5.草H交将30%的丙烯眈肢13.3mL，去离子水26.4mL,5倍电泳缓冲液10mL,10%过硫酸锻溶液500队，四甲基乙二肢(TEMED)40L，轻轻泪匀，缓缓灌入玻璃胶室，持胶室灌满之后，插入配套样品梳，聚合1小时。7.4.5 预电泳轻轻拔出样品梳，在电泳槽内倒入1f音电泳缓冲溶液至淹没较短的玻璃板，负极在上，正极在下接通电路，打开电源100W功率预电泳30mi口，并赶走胶孔的气泡。7.4.6 PCR扩增产物处理在PCR产物中加入加样缓冲液2L，混匀O7.4.7 电泳将处理后的PCR产物，用移液检吸取5L加入到胶孔中，150 W恒功率电泳，约1小时，关闭电源。7.4.8 染色拆下玻璃板，除去琼脂胶，将聚丙烯酷肢i疑胶轻轻地从玻璃板剥离，放入凝胶染色液，染色10mino取出胶块，用j清青水j冲中洗1mi口7.5 成像将胶块置于凝胶成像分析仪中，记录结果并保存起来。8 品种真实性鉴定4 D863/T 1479-2016 持测品种个体制备试样，以资料性附录B中的SSR引物进行PCR扩增，若被测样品中所有SSR标记位点扩增条带与附录C和附录D中描述一致，可判定为真实性青海草地早熟禾种子。9 品种纯度检泪IJ按照GB/T3543.2的规定取样，耳又不少于100个待测个体制备试样进行纯度鉴定。品种纯度(P)的数直以%表示(保留1位小数)，按公式(1)计算:N2 p=x 100%.(1)Nl 式中:P一品种纯度:N1一检测种于数:N2一判断为真实性的种于数。3 D863/T 1479-2016 附录A(规范性附录)主要仪器设备及试剂A.1 主要仪器设备PCR扩增仪、垂直板电泳槽、高压电泳仪C600V连续可调，0 mA400 mA连续可调，额定输出功率为100W)、恒温水浴锅COC100 C)、天平(精度O.01 g,O.0001 g各一台)、磁力搅拌机、高速台式离心机C14000 r/min)、高通量组织研磨仪、紫外分光光度计、紫外在是胶成像仪、高压灭菌锅、酸度计、微量移液器00L、100L、1000L)、冰箱、脱色槽。A.2 主要试剂乙二肢四乙酸二铀Cethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-Na、三贯主甲基氨基甲炕Chydroxymethylaminometha肘，Tris)、盐酸(HC1)、十二炕基硫酸讷Csodiumdodecyl sulfa te,SDS)、十六炕基三甲基澳化镇Ccetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)、三氯甲炕Cchloroform)、异戊醇Ci soamy 1 alcohol)、氢氧化铀CNaOH)、液氮、四种脱氧核糖核昔酸CdNTPsdATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合格液、引物Cprimer)、TaqDNA聚合酶CTaqpolymerase)、丙烯酷肢Cacrylamide)、甲叉双丙烯肢胶CN，N-methyleme bisacrylamide)、四甲基乙二胶Ctetramethylethylenediami时，TEMED)、过硫酸肢Cammoniumpersaliate,APS)、棚酸Cboricacid)、澳酣兰Cbromophenolblue)、二甲苯青Cxylenecyanol)、澳化乙链Cethidiumbromide,EB)0 常规生化试剂等级要求为分析纯。6 名称poap5 F R Poap9 F R PoaplO F R 附录B(规范性附录)SSR寻|牧l参数图B.1 SSR引物参数序列退火温度CC)GCTTCTTAGAATGGAGGTC 55 ATCAGAGGGAGATTTTGC AGAGGAAAACTCTTCTCTCTG 55 GAAAGCAACAAGCACCT TCGCTTGAGTTGCTGTAC 50 AAGGTTTCCAAATAGGCT DB63/T 1479-2016 分子量Cbp)223 154 220 7 D863/T 1479-2016 附录c(资料性附录)青海草地早熟禾SSR分子标记鉴定电泳图谱C.1 青海草地早熟禾与其他早熟禾品种的SSR电泳图语Poap5 poap9 poaplO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M 300bp 一-曰.L.I ,.Z =，200bp 300bp 一，.，.1-圈-r圈国*，.，一I，.回;嘈-.，、111!11-.,200bp h1:-.】:-】!h300bp 200bp 注1:1青海草地早熟禾2骑士3布鲁克4公园5世外桃源6肯塔基7武士8爱美9午夜10黑珍珠11帝国12奖品13水晶14优异15勇士16白斯特17青海届主早熟禾18青海冷地早熟禾Mmarker C.2 青海草地早熟禾品种群体鉴定SSR电泳图谱poap5 poap9 poapl0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16 1718 19 2021 22 23 2425 2627 2829 30 M y坷E:1I:J豆，坷，J户I300bp 200bp 200bp 300bp-，、.200bp h.-】=:12注2:M mark盯1青海草地早熟禾个体SSR标记鉴定(长箭头所指头j杂种多态性条帝，短箭头不品种内多态性条带)8 D863/T 1479-2016 附录D(规范性附录)青海草地早熟禾SSR分子标记鉴定模式图D.1 青海草地早熟禾SSR分子标记鉴定模式图Marker Poap5 Marker Poap5 300bp-300bp-200bp-200bp-Marker Poap9 Marker Poap9 300bp-300bp-200bp-200bp-Marker Poapl0 300bp-200bp-9