DB42_T 1110-2015 牛支原体体外药物敏感性检测操作规程(湖北省).pdf
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1、TCS 11.220 B 41 备案号:DB42 湖北省由巳ET且,万标准DB 42/T 1110-2015 牛支原体药物敏感性体外检测操作规程Technique guideline on drug sensitivity test ofMycoplasma bovis in vitro(报批稿)2015-10-30发布2015-12-20实施湖北省质量技术监督局发布DB42/T 1110-2015 目次前言.II 引言.1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 缩略语.1 4 原理.1 5 操作步骤.2 5.1 仪器与耗材.2 5.2 菌株.2 5.3 操作步骤.2 5.4 结果判断.3 5
2、.5 实验废弃物的处理.3 附录A(规范性附录)试剂配制.4 附录B(资料性附录)牛支原体颜色变化单位测定方法.6 附录c(规范性附录)药物敏感性判断标准.7 参考文献.9 DB42/T 1110-2015 目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由华中农业大学提出C本标准由华中农业大学归口管理。本标准起草单位:华中农业大学。本标准协作起草单位:随州市弘大畜牧有限责任公司、湖北省松滋市春珍肉牛养殖场。本标准起草人:郭爱珍、贺晨飞、是金、陈颖、钮、胡长敏、曹永强、周春、陈焕春。II DB4
3、2/T 1110-2015 号|-L-E司牛支原体(Mycoplasmbo巾,Mbovis)是牛的一种重要病原体,主要导致牛肺炎,也可致乳腺炎、关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种病症。该病在世界范围内流行。我省于2008年在全国首次报道肉牛的牛支原体肺炎,发病率为50%100%,病死率高达10%50%,给养牛业造成了巨大的经济损失。目前牛支原体病的主要控制措施是抗生素治疗。但由于牛支原体无细胞壁,对常用内眈肢酶类抗菌药不敏感,对其它抗菌药如喳诺酣类、大环内醋类、氨基糖昔类等虽具有一定的敏感性,但治疗周期长,效疗差,耐药性产生快。因此,体外药物敏感性检测能为r白床治疗筛选敏感
4、药物,提高临床治疗效果,同时可用于监测牛支原体耐药性产生的趋势。然而,目前国内外尚无牛支原体体外药物敏感性检测的技术标准,一定程度上阻碍了该病的有效防治。为此,特制定本标准,旨在为我省牛支原体的有效防控提供技术支持,以推动我省养牛业的健康发展。III DB42/T 1110-2015 牛支原体体外药物敏感性检测操作规程1 范围本标准规定了牛支原体体外药物敏感性检测技术的缩略语、原理和操作步骤规程。本标准适用于湖北地区牛支原体临床分离株的药物敏感性分析、耐药性流行病学调查和牛支原体病的临床治疗。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本
5、文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 18597 危险废物贮存污染控制标准DB42/T 1024 牛支原体肺炎检测技术CLSI M100-S22 抗生素敏感性检测操作标准Performancestandards for antimicrobial susceptibility testing 中华人民共和国国务院令(2003)第380号医疗废物管理条例3:宿略语以下缩略i吾适用于本标准。3.1 M bovs牛支原体帅cop/asmabovs 3.2 PPLO 胸膜肺炎样微生物Pleuropnenmonia
6、-I ike Organism 3.3 MIC 最低抑菌浓度Minimum inhibitory concentration 3.4 CCU 颜色变化单位Color changing unit 3.5 ATCC 美国菌种保藏中心Arr阳icanType Culture Col lection 3.6 CLSI 临床和实验室标准协会CI inical And Laboratory Standards Institute 4 原理在液体培养基中,牛支原体生长产酸,将导致培养基颜色改变,由红色变为黄色。当抗生素发生抑菌:gJG杀菌作用时,因无牛支原体生长,培养基将维持红色。抗生素抑制牛支原体生长的强
7、弱以最低抑菌浓度(MTC)表示,用微量肉汤稀释法测定,具体方法如下:在96孔板内依次加入倍比稀释的抗菌药,再加入等体积适当稀释的牛支原体液体培养物,置于3TC,DB42/T 1110-2015 5%C02培养箱中培养48h,观察每个孔内颜色的变化,颜色由红色变为黄色表示有牛支原体生长。以不改变检测管颜色的药物最高稀释倍数所对应的药物浓度也/mL)为MlCo5 操作步骤5.1 仪器与耗材H级生物安全柜,二氧化碳培养箱,96孔细胞培养板,微量可调移液器及枪头,2 mL一次性无菌离心管,混匀器,冰箱,天平,高压消毒锅,0.22m微孔滤膜。5.2 菌株标准菌株:美国微生物菌种保藏中心牛支原体参考株Mb
8、ovis PG45(ATCC 25523)临床分离菌株面床病料分离纯化的菌株,菌株鉴定按照DB42/T1024中的要求进行。5.3 操作步骤5.3.1 抗菌药溶液配制根据抗菌药特性,用相应溶剂(如1M氢氧化铀、乙醇或去离于水)将抗菌药溶解,然后用去离子水将抗菌药稀释成1mg/mL的储存液,-80oC保存。使用前将储存液用去离于水稀释至所需工作液浓度,40C保存备用,各药物贮存液配制方法参照CLSTM100-S22,见附录A.1。去高于水的制备按照GB!T6682的要求进行。5.3.2 菌株复苏鉴定将保存于_200C含20%甘泊的菌液取出,吸取100L菌液接种于900LPPLO液体培养基内,置于
9、普通培养箱中3TC培养48h72 ho取20L复苏菌液转接于60mmPPLO琼脂平板上,PPLO液体和固体培养基配制见附录A.2,置于3TC,5%CO2培养箱中培养48h72 h,在显微镜下标记出形态典型的支原体单菌落,在超净台内将标记的单菌落挑出,再次接于PPLO液体培养基内培养,取培养物进行16SrRNA 通用PCR和uvrC特异性PCR检测,方法见DB42/T1024标准的要求。5.3.3 牛支原体颜色变化单位测定将牛支原体用PPLO液体培养基作10倍递增稀释,置于普通培养箱中3TC二氧化碳培养箱中培养48h72h,观察培养液的颜色变化,以出现颜色变化的最后l管所对应的牛支原体稀释倍数作
10、为颜色变化单位,表示为CCU/mL,具体操作见附录B.l。5.3.4 最低抑菌浓度测定采用微量肉汤稀释法测定牛支原体最低抑菌浓度。在96孔板内,第19列每孔加入100CCUPPLO 液体培养基pH值7.6,第1列加入工作浓度的抗菌药,泪匀后从各孔中取100L至第2列各孔,依次音比稀释至第9列,第9列弃去100L,使每孔体积相同。第10列各孔加入100LPPLO培养基作为牛支原体生长阳性对照:第11列各孔加入200).lLpH值6.8PPLO培养基呈黄色作为对照12列各孔加入200L培养基作为无菌阴性对照呈红色。将复苏和鉴定正确的牛支原体液体培养物按1:10接种至PPLO液体培养基中,置于370
11、C,5%CO2培养箱中培养24h,菌量约为1081 09 CCU/mL后,将菌i夜稀释至104倍,备用。第19列各孔加入100L预先稀释好的菌液:第10列加入100L菌液;第川列和第12列不加菌液。每株菌做3个重复。将培养板用封口膜密封,置于370C,普通培养箱中培养48h,在不同时间观察每个孔内颜色的变化并记录,并与2 DB42/T 1110-2015 阳性对照第10列和阴性对照第12列比较,不发生颜色变化的最低药物浓度为MIC,见附录C图C.l,然后计算对应孔的抗菌溶度(!lg/mL)0 5.4 结果判断根据各药物的MIC值,将牛支原体对药物的敏感性分为敏感(Susceptible,S)、
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