GB∕T 40171-2021 磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则.pdf
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1、ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和回国家标准GB/T 40171-2021 磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则General rules for determination of magnetic bead DNA extraction and purification kit 2021-05-21发布国家市场监督管理总局岳舍国家标准化管理委员会保W2021-12-01实施GB/T 40171-2021 目IJ1=1 本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别
2、专利的责任。本文件由全国生化检测标准化技术委员会CSAC/TC387)提出并归口。本文件起草单位:中国测试技术研究院生物研究所、苏州白主纪生物科技有限公司、成都海关技术中心、深圳华大智造科技股份有限公司、深圳市计量质量检测研究院、圣湘生物科技股份有限公司、迈克生物股份有限公司、四川大学、北京市理化分析测试中心、湖南圣维基因科技有限公司、苏州新波生物技术有限公司o本文件主要起草人:周李华、马丽侠、林华、李怀平、蒋子敬、林霖、王逸丛、叶德萍、邓中平、龙腾镶、姜展槌、谢礼、曲峰、蒋慧、杨国武、龚华斐、安徽、郭刚、张娟、戴立忠、杜美红。I GB/T 40171-2021 磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测
3、通则1 范围本文件规定了磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则,描述了检测原理、检测前准备,以及对磁珠法DNA提取纯化试剂盒磁力学性质、DNA提取纯化、DNA浓度和纯度、DNA得 量、DNA完整性、磁珠吸附率、提取回收率、精密度的检测方法以及检测报告。本文件适用于植物组织,动物组织,血液、血斑、血凝块、血浆等,唾液、精液、尿液、粪便等分泌物,细菌、病毒、真菌等生物样本中的磁珠法DNA提取试剂盒的测定o2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
4、。GB 5009.268 食品安全国家标准食品中多元素的测定GB/ T 19077粒度分析激光衍射法GB/ T 21649.1 粒度分析图像分析法第1部分:静态图像分析法GB/ T 29022 粒度分析动态光散射法CDLS)GB/ T 34794 琼脂糖凝胶回收试剂盒测定通则GB/ T 34796 水熔液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法SN/ T 2775 商品化食品检测试剂盒评价方法3 术语和定义GB/ T 34794和GB/T34796界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 磁珠magnetic beads 一种表面经过了功能化修饰,包被有生物活性基团的功能化载体,在磁场中能够迅
5、速聚集,离开磁场后又能快速分散,实现在不同条件下与核酸分子特异性高效结合和解离的具有超顺磁性的一种磁性纳米级或者微米级球状或无定形颗粒物。3.2 注1:其表面修饰有丰富的活性基团,可以与核酸分子在一定的缓冲条件下进行可逆地结合。注2:与传统的分离方法相比,磁珠用于生化样品复杂组分的分离,能够实现分离和富集同时进行,有效地提高了分离速度和富集效率,同时也使分析检测的灵敏度大大提刑。注3:本文件中磁珠指生物分离磁珠。这类磁珠具有超)1民磁性,可分散于基液中形成磁性液体材料,生物活性基团可以与多种生物活性物质发生偶联,兼具有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点,具有确定的粒径范围,有确定的表面特
6、性,包括比表面积、表面修饰等。磁珠吸附率adsorption rate of magnetic beads 一定条件下,磁珠吸附到的核酸占总核酸量的比例。GB/T 40171-2021 3.3 3.4 3.5 磁晌应时间magnetic response time DNA提取磁珠放置于磁力架或用磁棒磁吸附后,完全磁分离的时间o样本提取回收率recovery rate for sample extraction 样本提取DNA的量与样品中实际DNA量的比值。得量yield 从单位质量样本中提取所得的DNA的量。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。cfDNA:循环游离DNACcirculatingc
7、ell-free DNA) ctDNA:循环肿瘤DNACcirculatingtumor DNA) DNA:脱氧核糖核酸Cdeoxyribonucleicacid) OD:光密度Copticaldensity) PCR:聚合酶链式反应Cpolymerase chain reaction ) 5 原理运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面用氧化硅、竣基基团、是基基团、多聚胸腺略院重复寡核音酸Oligo(dT)等修饰后,制备成为功能性超顺磁性纳米磁珠。利用纳米磁珠的超JI顶磁性,在离液盐(盐酸肌、异硫氨酸肌等)和外加磁场的作用下,从生物样本中有效结合DNA,在低盐或者水溶液状态下与磁珠结合的DNA被
8、可逆地洗脱下来,实现核酸的提取纯化的目的。6 检测前准备6.1 样晶数量采用至少3个不同批次的试剂盒,每一批次的试剂盒分别对20份待测样品、20份加标样品进行提取纯化。加标样品的加标浓度在试剂盒提供的浓度范围。同时采用参考方法进行检测。结果表示按照SN/ T 2775的规定执行。6.2 提取样品的选择用于试剂盒提取回收率检测的生物样品建议选择参考样品。力日标测试可选用在售的有证标准物质或参考样品,亦可采用己知提取效率的等效样品。检测时,根据不同试剂盒适用的样本类型采用不同的标准物质或参考样品进行检测。注:本文件涉及的参考样品指经过严格的研制流程,具有确定的一个或多个足够均匀的特性值的材料,如动
9、物组织冻干粉,植物叶片、种子的冻干粉,参考血样,假病毒等样本。6.3 试剂盒外观试剂盒外包装应无破损,标识清晰。试剂盒应附说明书,根据说明书检查,内容物应齐全;磁珠悬浮液为黑色、棕色或者棕黄色悬浊液,其他组分应符合说明书描述。GB/T 40171-2021 6.4 试剂盒装量试剂的装量应不少于试剂盒说明书要求的量。7 检测方法7.1 试样预处理按照试剂盒说明书的要求执行。7.2 磁力学性质试剂盒说明书给出了磁珠磁力学性质指标的,按照附录A进行测定。7.3 磁珠法DNA提取纯化根据磁珠法DNA提取纯化试剂盒说明书进行。7.4 DNA浓度和纯度检测7.4.1 紫外吸收法(大量DNA检测)针对从动物
10、组织、植物组织、血液、血斑、血凝块、唾液、口腔拭子、尿液、细菌等生物样本中提取的DNA的浓度和纯度检测方法,按照GB/T34796的规定执行。检测时建议调整OD260吸收值在对应的仪器要求范围内,OD260/0D280比值会受pH影响较大,建议使用对应的DNA洗脱液作为检测溶剂,并设置空白对照。7.4.2 荧光法(微量DNA检测)见中华人民共和国药典c四部,2020年版)。7.4.3 琼脂糖电泳测量法将待测DNA与已知浓度的DNA同时进行电泳,根据结合的澳化乙链荧光强度,估计其含量。根据电泳图谱判断DNA纯度。7.4.4 实时荧光PCR法根据待测DNA样本选择相应的标准物质和引物探针序列,进行
11、PCR扩增,以标准物质起始模板DNA浓度的对数为横坐标,Ct值为纵坐标,制作标准曲线。根据标准曲线,计算待测DNA的浓度。7.4.5 数字PCR法采用数字PCR方法对待测DNA样本进行定值,设置2个3个浓度梯度,每个浓度设置至少3个重复,根据数字PCR结果,计算待测DNA浓度。7.5 DNA得量检测7.5.1 基本原则根据说明书给出的提取样本用量选取至少3个样本用量梯度,需涵盖最少用量和最多用量(如人新鲜血液试剂盒推荐用量为100L250L,选取梯度可为100L,200L,250L三个用量梯度),按照试剂盒使用说明书进行DNA提取,按照GB/T34796的规定计算得量,得出对应样本用量的得量范
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