GB∕T 40171-2021 磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则.pdf

ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和回国家标准GB/T 40171-2021 磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则General rules for determination of magnetic bead DNA extraction and purification kit 2021-05-21发布国家市场监督管理总局岳舍国家标准化管理委员会保W2021-12-01实施GB/T 40171-2021 目IJ1=1 本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生化检测标准化技术委员会CSAC/TC387)提出并归口。本文件起草单位:中国测试技术研究院生物研究所、苏州白主纪生物科技有限公司、成都海关技术中心、深圳华大智造科技股份有限公司、深圳市计量质量检测研究院、圣湘生物科技股份有限公司、迈克生物股份有限公司、四川大学、北京市理化分析测试中心、湖南圣维基因科技有限公司、苏州新波生物技术有限公司o本文件主要起草人:周李华、马丽侠、林华、李怀平、蒋子敬、林霖、王逸丛、叶德萍、邓中平、龙腾镶、姜展槌、谢礼、曲峰、蒋慧、杨国武、龚华斐、安徽、郭刚、张娟、戴立忠、杜美红。I GB/T 40171-2021 磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则1 范围本文件规定了磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则，描述了检测原理、检测前准备，以及对磁珠法DNA提取纯化试剂盒磁力学性质、DNA提取纯化、DNA浓度和纯度、DNA得 量、DNA完整性、磁珠吸附率、提取回收率、精密度的检测方法以及检测报告。本文件适用于植物组织，动物组织，血液、血斑、血凝块、血浆等，唾液、精液、尿液、粪便等分泌物，细菌、病毒、真菌等生物样本中的磁珠法DNA提取试剂盒的测定o2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 5009.268 食品安全国家标准食品中多元素的测定GB/ T 19077粒度分析激光衍射法GB/ T 21649.1 粒度分析图像分析法第1部分:静态图像分析法GB/ T 29022 粒度分析动态光散射法CDLS)GB/ T 34794 琼脂糖凝胶回收试剂盒测定通则GB/ T 34796 水熔液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法SN/ T 2775 商品化食品检测试剂盒评价方法3 术语和定义GB/ T 34794和GB/T34796界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 磁珠magnetic beads 一种表面经过了功能化修饰，包被有生物活性基团的功能化载体，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能快速分散，实现在不同条件下与核酸分子特异性高效结合和解离的具有超顺磁性的一种磁性纳米级或者微米级球状或无定形颗粒物。3.2 注1:其表面修饰有丰富的活性基团，可以与核酸分子在一定的缓冲条件下进行可逆地结合。注2:与传统的分离方法相比，磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提刑。注3:本文件中磁珠指生物分离磁珠。这类磁珠具有超)1民磁性，可分散于基液中形成磁性液体材料，生物活性基团可以与多种生物活性物质发生偶联，兼具有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点，具有确定的粒径范围，有确定的表面特性，包括比表面积、表面修饰等。磁珠吸附率adsorption rate of magnetic beads 一定条件下，磁珠吸附到的核酸占总核酸量的比例。GB/T 40171-2021 3.3 3.4 3.5 磁晌应时间magnetic response time DNA提取磁珠放置于磁力架或用磁棒磁吸附后，完全磁分离的时间o样本提取回收率recovery rate for sample extraction 样本提取DNA的量与样品中实际DNA量的比值。得量yield 从单位质量样本中提取所得的DNA的量。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。cfDNA:循环游离DNACcirculatingcell-free DNA) ctDNA:循环肿瘤DNACcirculatingtumor DNA) DNA:脱氧核糖核酸Cdeoxyribonucleicacid) OD:光密度Copticaldensity) PCR:聚合酶链式反应Cpolymerase chain reaction ) 5 原理运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面用氧化硅、竣基基团、是基基团、多聚胸腺略院重复寡核音酸Oligo(dT)等修饰后，制备成为功能性超顺磁性纳米磁珠。利用纳米磁珠的超JI顶磁性，在离液盐(盐酸肌、异硫氨酸肌等)和外加磁场的作用下，从生物样本中有效结合DNA，在低盐或者水溶液状态下与磁珠结合的DNA被可逆地洗脱下来，实现核酸的提取纯化的目的。6 检测前准备6.1 样晶数量采用至少3个不同批次的试剂盒，每一批次的试剂盒分别对20份待测样品、20份加标样品进行提取纯化。加标样品的加标浓度在试剂盒提供的浓度范围。同时采用参考方法进行检测。结果表示按照SN/ T 2775的规定执行。6.2 提取样品的选择用于试剂盒提取回收率检测的生物样品建议选择参考样品。力日标测试可选用在售的有证标准物质或参考样品，亦可采用己知提取效率的等效样品。检测时，根据不同试剂盒适用的样本类型采用不同的标准物质或参考样品进行检测。注:本文件涉及的参考样品指经过严格的研制流程，具有确定的一个或多个足够均匀的特性值的材料，如动物组织冻干粉，植物叶片、种子的冻干粉，参考血样，假病毒等样本。6.3 试剂盒外观试剂盒外包装应无破损，标识清晰。试剂盒应附说明书，根据说明书检查，内容物应齐全;磁珠悬浮液为黑色、棕色或者棕黄色悬浊液，其他组分应符合说明书描述。GB/T 40171-2021 6.4 试剂盒装量试剂的装量应不少于试剂盒说明书要求的量。7 检测方法7.1 试样预处理按照试剂盒说明书的要求执行。7.2 磁力学性质试剂盒说明书给出了磁珠磁力学性质指标的，按照附录A进行测定。7.3 磁珠法DNA提取纯化根据磁珠法DNA提取纯化试剂盒说明书进行。7.4 DNA浓度和纯度检测7.4.1 紫外吸收法(大量DNA检测)针对从动物组织、植物组织、血液、血斑、血凝块、唾液、口腔拭子、尿液、细菌等生物样本中提取的DNA的浓度和纯度检测方法，按照GB/T34796的规定执行。检测时建议调整OD260吸收值在对应的仪器要求范围内，OD260/0D280比值会受pH影响较大，建议使用对应的DNA洗脱液作为检测溶剂，并设置空白对照。7.4.2 荧光法(微量DNA检测)见中华人民共和国药典c四部，2020年版)。7.4.3 琼脂糖电泳测量法将待测DNA与已知浓度的DNA同时进行电泳，根据结合的澳化乙链荧光强度，估计其含量。根据电泳图谱判断DNA纯度。7.4.4 实时荧光PCR法根据待测DNA样本选择相应的标准物质和引物探针序列，进行PCR扩增，以标准物质起始模板DNA浓度的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，制作标准曲线。根据标准曲线，计算待测DNA的浓度。7.4.5 数字PCR法采用数字PCR方法对待测DNA样本进行定值，设置2个3个浓度梯度，每个浓度设置至少3个重复，根据数字PCR结果，计算待测DNA浓度。7.5 DNA得量检测7.5.1 基本原则根据说明书给出的提取样本用量选取至少3个样本用量梯度，需涵盖最少用量和最多用量(如人新鲜血液试剂盒推荐用量为100L250L，选取梯度可为100L，200L，250L三个用量梯度)，按照试剂盒使用说明书进行DNA提取，按照GB/T34796的规定计算得量，得出对应样本用量的得量范GB/T 40171-2021 围。常用试剂盒样本提取用量和得量见附录B的表B.1。7.5.2 基因组DNA针对从血液、血斑、血凝块、血浆、唾液、口腔拭子、尿液、动植物组织等生物样本中提取的基因组DNA，使用微量紫外分光光度计，通过测量OD值进行核酸得量检测，具体要求和步骤按照GB/T 34796的规定执行。7.5.3 微量cfDNA或ctDNA针对从血浆或血清样本中提取的微量cfDNA或ctDNA，建议使用实时荧光计或生物芯片分析系统、微流控毛细管电泳系统，进行核酸得量检测。7.5.4 微量病毒DNA针对从血浆、血清等生物样本中提取的微量病毒DNA，采用实时荧光PCR法，通过检测特定基因的Ct进行DNA浓度检测，方法按照7.4.4进行。或采用数字PCR方法检测样本中DNA浓度，根据定值结果计算其DNA浓度，方法按照7.4.5。7.6 DNA完整性检测7.6.1 检测方法DNA完整性检测一般采用琼脂糖凝胶电泳法、微流控芯片法或毛细管电泳分离法，也可参考其他方法进行DNA完整性检测。病毒DNA、cfDNA和ctDNA不建议进行DNA完整性检测。7.6.2 凝胶电泳法取2L5L提取后的基因组DNA样品溶液与适量6X上样缓冲液混合，在1%琼脂糖凝胶中以3V /cm5 V /cm恒压条件下电泳40min，用凝胶成像系统观察DNA条带，要求所得DNA条带单一、清晰、片段大小合适、无拖带及明显降解情况。注:根据具体样本调整电泳条件。7.6.3 微流控芯片或毛细管的电泳分离法取10ng DNA样本置于微流控芯片或毛细管的电泳中，根据仪器使用说明书进行基因组DNA分析，查看DNA样品中DNA片段的分布情况，对弥散的DNA进行分析。7.7 磁珠吸附率按照附录A进行测定。7.8 提取回收率测试在适用的前提下，根据说明书给出的得量，在相应基质中添加3个浓度水平的DNA标准物质(所添加的浓度范围应涵盖高、中、低三个水平)，按照试剂盒使用说明书进行DNA提取，每个添加水平重复提取7次，按照GB/T34796的规定计算得量，按式(1)计算提取回收率CPb)。从血浆和血清等样本中提取的病毒DNA、cfDNA和ctDNA等微量DNA产物，采用实时荧光PCR法检测Ct值。4 m.o Pb =-二X100% mb1 . ( 1 ) GB/T 40171-2021 式中:Pb 回收率;1n bl 加人标准DNA的量，单位为微克(g); nl b2 每个浓度水平提取得到的DNA量的平均值，单位为微克(g)。7.9 精密度测定7.9.1 批内精密度在适用的前提下，根据试剂盒说明书使用同一批次3个试剂盒对参考样品重复提取7次，根据式(2)计算批内提取DNA得量的变异系数。从血浆和血清等样本中提取的病毒DNA、cfDNA和ctDNA等微量DNA产物，进行批内精密度测定时，采用实时荧光PCR法检测Ct，以Ct计算变异系数(CV)。式中:SD cv =王二x100 % cv 提取DNA得量的变异系数;SD-7次提取DNA量的标准偏差;X -7次提取DNA量的平均值。7.9.2 批间精密度. ( 2 ) 在适用的前提下，根据试剂盒说明书使用3个不同批次试剂对参考品分别重复提取7次，根据式(2)计算批间提取DNA得量的变异系数。从血浆和血清等样本中提取的病毒DNA、cfDNA和ctDNA等微量DNA产物，进行批间精度测定，采用实时荧光PCR法检测Ct，以Ct计算变异系数。7.10 参考结果提取纯化的DNA得量、纯度、完整性和提取回收率等试剂盒提取产物检测参考结果见附录B。一般情况下，磁珠吸附率检测以磁珠吸附率的变异系数表征，在使用有效期内，参考结果见附录C。采用添加一定浓度范围的DNA标准物质至样品中进行提取回收率测试，样本提取回收率应符合试剂盒生产商的规定，参考结果见附录C。8 检测报告试剂盒出厂或经测定后应附检测报告，或质检报告，或等同的指导性文件，文件格式见附录D，文件内容在适用的前提下，应至少包括以下部分:a) 试剂盒的应用范围:包括适用样本及样本的特殊说明;b) 得量;c) 纯度;d) 完整性;的提取回收率;f) 批内、批间精密度。GB/T 40171-2021 A.1 粒径大小及分布A.1.1 显微图像法附录A(规范性)试剂盒的磁力学性质指标测试按GB/T21649.1的规定执行，得到显微图像，通过统计分析得出磁珠的平均粒径(dmean )和标准差(5)。A.1.2 激光粒度分析法将磁珠分散在缓冲液中，超声5mi口，振荡混匀，粒径大于1m的磁珠按GBjT19077的规定执行，粒径小于1m的磁珠按GB/T29022的规定执行，检测得出磁珠的平均粒径(dmean )及分散指数(PD。A.2 磁晌应时间将磁珠磁性分离进行计时，记录磁响应时间。A.3 重分散性将磁珠分散在缓冲液中，超声(频率40kHz，功率180W) 5 min.振荡混匀，将此磁珠分散液于离心机上采用3000 r/min速度离心3min，加速沉淀，随后涡旋振荡30s，在己确定的吸收波长下测试分散液的吸光度值(Aj)重分散率(Prd)数值以%表示，按式(A.l)计算:Prd =生川. ( A.l ) 式中:P rd 重分散率;A l 离心后磁珠重悬液的吸光度;A。磁珠分散液的吸光度。A.4 磁稳定性将磁珠分散在缓冲液(不含有铁离子)中，超声(频率40kHz，功率180W)5 mi口，并在37oc下以200 r/min振荡5h.磁分离后取上清分散液，按GB5009.268中第二法规定检测游离铁离子浓度。磁珠不应有铁离子溶出。A.5 磁珠吸附率在适用的前提下，使用磁珠对适量DNA标准品进行吸附，重复7次，计算磁珠吸附DNA标准品后的量与吸附前的DNA标准品的量的百分比。6 附录B(资料性)磁珠法DNA提取试剂盒提取性能验证磁珠法DNA提取试剂盒样本的提取量、得量及纯度参考结果见表B.l。表B.1样本提取量、得量及纯度一览表样本类型提取DNA类型样本量o D260 / 0 D280 基因组DNA200L 1.62.1 全血基因组DNA1 mL 1.62.1 血斑基因组DNA3mmX3mm，1片3片1.62.1 血凝块基因组DNA1 mL 1.62.1 唾液基因组DNA200L 1.62.1 口腔拭子基因组DNA一支1.62.1 尿液基因组DNA10 mL15 mL原尿1.62.1 组织(动物/人)基因组DNA30 mg50 mg 1.62.1 新鲜植物叶片基因组DNA50 mg80 mg 1.72.1 血浆/血清cfDNA、ctDNA2 mL N/ A GB/T 40171-2021 OD260/0D230 DNA得量fJ-g 1.52.5 26 1.52.5 1O20 0.82.0 0.53 1.52.5 1020 1.02.5 15 1.02.5 15 1.02.5 。101.02.5 215 1.52.5 840 N/ A 820 7 GB/T 40171-2021 附录C(资料性)磁珠法DNA提取试剂盒检测参考结果磁珠法DNA提取试剂盒磁力学性质、提取纯化产物、磁珠吸附率提取回收率以及批内、批问精密度等检测参考结果见表C.l。表C.1磁珠法DNA提取试剂盒检测参考结果一览表序号检测项目参考结果磁力学性质见试剂盒说明书2 提取纯化产物见附录B3 磁珠吸附率变异系数小于或等于10%4 样品提取回收率符合试剂盒生产商的规定动植物组织基因组DNA变异系数应小于或等于15%人血基因组DNA(不含血清或血浆游离浓度值，1ft内的重复性误差应小于或等于15%DNA) 浓度值，1ft间的重复性误差应小于或等于20%浓度值，批内的重复性误差应小于或等于20%批内，1ltI可浓度值，1ft间的重复性误差应小于或等于20%5 微量DNA，包括cfDNA、ctDNA等精密度Ct值，批内重复性误差应小于或等于5%Ct值，才tt间重复性误差应小于 或等于10%Ct值，其批内重复性误差应小于或等于5%病毒DNACt值批间重复性误差应小于或等于10%其他DNA应符合试剂盒说明书或生产商的规定8 附录D(资料性)磁珠法ONA提取试剂盒检测记录格式磁珠法DNA提取试剂盒的检测记录表见表D.l。表0.1磁珠法ONA提取试剂盒检测记录表品名规格生产厂家生产日期供货单位外观测试样本称样量ODZ60/0Dz80 DNA得量完整性GB/T 40171-2021 批号有效期保存条件提取回收率批内精密度GB/T 40171-2021 参考文献1J 国家药典委员会.中华人民共和国药典:四音i北京:中国医药科技出版社，2020.10