DB33∕T 2247-2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法(浙江省).pdf
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1、lCS 65. 020. 30 B 43 DB33 川、d江省山巳ETE, 万标准DB33/T 2247-2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法Method ofRT-PCR and the real-time RT-PCR for the detection of duck tembusu virus disease 2020 -03 -03发布2020 - 04 -03实施浙江省市场监督管理局发布目IJ1=1 本标准按照GB!T1. 1-2009给出的规则编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。DB33/T 224
2、7-2020 本标准起草单位:浙江省动物疫病预防控制中心、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人:云涛、徐辉、周彩琴、张存、赵灵燕、余斌、吴贯立在、张传亮、吴雪军、黄晓兵、j马肖肖、华炯钢、吕见涛、张娟敏、鲍伟华。DB33/T 2247-2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法1 范围本标准规定了鸭坦布苏病毒的反转录一聚合酶链式反应CRT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。本标准适用于鸭坦布苏病毒核酸的检测。2 术语和定义2. 1 鸭坦布苏病毒(DuckTembusu Virus, DTMUV) 属于黄病毒手斗、黄病毒
3、属、蚊媒病毒类、Ntaya病毒群,可引起鸭、鹅产蛋下降,雏鸭、雏鹅发病死亡。3 实验条件3. 1 主要仪器设备3. 1. 1 PCR 1义。3. 1.2 荧光定量PCR仪。3. 1.3 微量移液器。3.1.4 组织匀浆器。3.1.5 电泳仪。3.1.6 电泳槽。3.1.7 水浴锅。3. 1.8 紫外凝胶成像系统。3. 1.9 高速台式低温离心机。3. 1. 10 生物安全拒。3. 2 试剂3. 2. 1 O. 01M磷酸盐缓冲液CO.01 mol/L, pH7. 4 PBS):称职8.0g NaCl、U.2g KCl、2.9g NaPO川2H20、O. 2 g KH2P04,将上述试剂溶于80
4、0mL去离子水中,充分搅拌溶解,滴加浓盐酸将pH调节至7.4,然后加去离子水定容至1L,高温灭菌30mi丑,室温保存。3.2.2 氯仿。3.2.3 异丙醇。3.2.4 焦炭酸二乙醋(DEPC)处理的灭菌去离子水:用DEPC50队,加超纯水至100mL,室温过夜,1210C高压灭菌15mi口,分装到1.5 mL DEPC处理过的离心营,冻存备用O3.2.5 75%乙醇:取新开启的无水乙醇75mL,加DEPC水至100mL,昆匀,-20oC预冷。DB33/T 2247-2020 3.2.6 澳化乙链(E曰:取1.0 g 臭化乙链,加去离子水,定容至100mL。充分溶解后的澳乙皖溶液转移至棕色瓶中,
5、室温避光保存,其工作浓度为o.5g /mL 3. 2. 7 1xTAE缓冲液:取242g挂基甲基氨基甲皖(Tris)、37.2g二水乙二按四乙酸二纳、57.1mL 冰乙酸,加去离子水定容至1L,配置成50 xTAE电泳缓冲液:量取20mL的50 xTAE电泳缓冲液,加入去离子水定容至1L,室温保存。3. 2. 8 1%琼脂糖凝胶:称取1.0g琼脂糖,加入1xTAE电泳缓冲液100mL,轻轻泪匀后加热,使琼脂糖完全熔化。待琼脂糖胶冷至500C600C时,加EB溶液(终浓度O.5g/mU或5L核酸染料,摇匀后倒入制胶板中,厚度为3mm5 mm,室温凝固后取下电泳梳子,备用。3.2.9 DNA相对分
6、子质量标准物Marker:DL 2000。3.2.10 10 x加样缓冲液:称取25g聚庶糖、0.1g 臭酣蓝、O.1 g二甲苯青,加入灭菌双蒸水定容至100 mL 3. 2. 11 商品化的一步法实时荧光RT-PCR反应试剂盒。OneStep Prime ScriptlM盯PCRKi t CPerfect Real Time, TAKARA),含有盯-PCR缓冲液,酶混合物,dNTP泪合物,无RNA酶的水等。3.2.12 M-MLV反转录酶。3.2.13 RNA酶抑制剂。3.2. 14 TaqDNA聚合酶03.2.15 dNTPso 3.2.16 引物RT-PCR扩增引物,见表1;实时荧光定
7、量盯PCR引物和探针,见表20引物名称DTMUV寻|物PlDTMUV寻|物P2引物名称DTMUV引物问DTMUV寻|物P4DTMUV探毛|4 操作步骤与结果判定4.1 样品采集与处理4. 1. 1 组织器官表1RT-PCR扩增引物号|物序列5-GCAACCAGGCAAAGAGGTCATA -3 5 -AAGTGAGCCTCATCCATAATGAACA -3 表2实时荧光定量RT-PCR引物和探针引物序列(5了)AAGTCAGGCCAGGGAATCC CATGCACCCAGATTTGTTAACC FAM-CCGTCATCCAACATC-MGB 5. 1. 1. 1 用无菌摄子和剪刀采集患病或病死
8、禽类各种组织与器官(肝脏、卵巢、脑、脾脏、胸腺等), 装入一次性塑料袋或其它灭菌容器,编号。5. 1. 1.2 取待检组织样品适量(O.lg),按1:5倍(W/W)加入无菌O.1M PH 7.4 PBS,于灭菌井烘干的研钵或组织匀浆器中充分研磨,反复冻融2次后,4 C, 3000 r/min离心5mi丑,取上清1mL转至无菌的1.5 mL离心管中液,编号备用。2 DB33/T 2247-2020 4.1.2 抗凝血、血清4. 1.2. 1 抗;疑血用无菌注射器直接吸取全血,加入含抗凝剂(除肝素外)的抗凝管中,充分混匀,编号备用。4.1.2.2 血清用无菌注射器直接吸取全血,自然凝固,3000
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