DB22∕T 3078-2019 不同肥力耕地土壤微生物学指标 黑土(吉林省).pdf
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1、 ICS 65.020 B 01 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 30782019 不同肥力耕地土壤微生物学指标 黑土 Microbiological index of cultivated soil in different fertility dregree - Black soil 2019 - 12 - 25 发布 2020 - 02 - 01 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 30782019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由吉林省农业农村厅提出并归口。 本标准起草单位:吉林省农业科学院。 本标准主要起草人:吴海燕
2、、范作伟、陈帅民、李阳阳、沙洪林、迟畅、彭畅。 DB22/T 30782019 1 不同肥力耕地土壤微生物学指标 黑土 1 范围 本标准规定了黑土旱田不同肥力耕地土壤样品采集制备、化学肥力指标测定和微生物学肥力指标。 本标准适用于黑土旱田耕地土壤微生物学指标评价。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 32737 土壤硝态氮的测定 紫外分光光度 LY/T 1228 森林土壤氮的测定 NY/T 52 土壤水分测定法 NY/T 87 土壤全钾测
3、定法 NY/T 889 土壤速效钾和缓效钾含量的测定 NY/T 1121.1 土壤检测 第1部分:土壤样品的采集、处理和贮存 NY/T 1121.2 土壤检测 第2部分:土壤 pH 的测定 NY/T 1121.6 土壤检测 第6部分:土壤有机质的测定 NY/T 1121.7 土壤检测 第7部分:土壤有效磷的测定 NY/T 1121.24 土壤检测 第24部分:土壤全氮的测定 自动定氮仪法 NY/T 1848 中性、石灰性土壤铵态氮、有效磷、速效钾的测定 联合浸提-比色法 NY/T 1849 酸性土壤铵态氮、有效磷、速效钾的测定联合浸提-比色法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.
4、1 土壤肥力 soil fertility 土壤为植物正常生长提供并协调营养物质和环境条件的能力, 是土壤物理、 化学和生物学性质的综合反映。 3.2 土壤肥力指标 soil fertility index 用于评价土壤肥力水平的土壤物理、化学和微生物学性质的指标。 3.3 化学肥力指标 soil fertility chemical index 土壤 pH、有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、铵态氮、硝态氮、有效磷、速效钾等土壤肥力指标。 DB22/T 30782019 2 3.4 微生物学肥力指标 soil fertility microbial index 土壤微生物数量、土壤微生物量碳、
5、土壤微生物量氮、土壤酶活性等土壤微生物学指标。 3.5 土壤肥力评价 soil fertility evaluation 根据土壤肥力的物理、化学和生物学各指标、特性的数量和质量,对土壤肥力综合水平的评定。本标准是基于土壤化学肥力指标的评价。 4 样品采集制备 4.1 采集 7 月中旬至 8 月中旬,采集 0 cm 20 cm 土壤样品。采样应符合 NY/T 1121.1 的规定。 4.2 制备 样品采集后,去除石砾和植物残根等杂物,分装 2 份,1 份置于 4 冰箱保存,用于测定土壤含水量、微生物数量、土壤酶活性和微生物量碳、微生物量氮;另 1 份风干后用于测定土壤化学肥力指标。 5 土壤肥
6、力评价 5.1 化学肥力指标测定 检测方法按表 1 执行。 表1 不同肥力黑土耕地土壤化学肥力指标选择与检测方法 指标名称 检测方法 土壤 pH NY/T 1121.2 土壤含水量 / % NY/T 52 土壤全氮 /(g/kg) NY/T 1121.24 土壤全磷 /(g/kg) NY/T 87 土壤全钾 /(g/kg) NY/T 86 土壤有机质 /(g/kg) NY/T 1121.6 土壤碱解氮 /(mg/kg) LY/T 1228 土壤有效磷 /(mg/kg) NY/T 1121.7 土壤速效钾 /(mg/kg) NY/T 889 土壤铵态氮 /(mg/kg) NY/T 1848 NY
7、/T 1849 土壤硝态氮 /(mg/kg) GBT 32737 5.2 土壤肥力评价 土壤化学肥力参考值见表 2。 DB22/T 30782019 3 表2 土壤化学肥力参考值 肥力水平 有机质 g/kg 有效磷(P) mg/kg 速效钾(K) mg/kg 碱解氮(N) mg/kg 产量 kg/hm2 高肥力 30 35 180 180 12000 中肥力 20 30 25 35 110 180 120 180 10000 12000低肥力 20 25 110 120 10000 6 土壤微生物学肥力指标 6.1 微生物学肥力指标测定 6.1.1 微生物数量 测定细菌、真菌、放线菌的数量,方
8、法见附录 A。 6.1.2 微生物量碳 测定方法见附录 B。 6.1.3 微生物量氮 测定方法见附录 C。 6.1.4 土壤酶活性 测定脲酶、过氧化氢酶、磷酸酶、蔗糖酶活性,方法见附录 D。 6.2 土壤微生物学肥力评价 6.2.1 微生物数量参考值 微生物数量参考值见表 3。 表3 不同肥力土壤微生物数量参考值 肥力水平 微生物数量 / Log(cfu/g 干土) 低肥力 中肥力 高肥力 细菌 8.29 8.29 8.51 8.38 真菌 4.03 2.97 4.10 3.4 放线菌 5.87 5.80 6.68 6.61 6.2.2 微生物量碳、氮参考值 微生物量碳、氮参考值见表 4。 D
9、B22/T 30782019 4 表4 不同肥力土壤微生物量碳、氮参考值 肥力水平 微生物量 低肥力 中肥力 高肥力 微生物量碳 /(mg/kg) 205.58 204.3 308.93 278.86 微生物量氮 /(mg/kg) 61.55 56.8 95.87 87.11 6.2.3 土壤酶活性参考值 土壤酶活性参考值见表 5。 表5 不同肥力土壤酶活性参考值 肥力水平 酶活性 低肥力 中肥力 高肥力 脲酶 /(NH3 -N mg/g/24h) 12.10 11.45 27.11 22.74 过氧化氢酶 /(mL KMnO4/g 干土) 1.83 1.48 2.40 2.07 磷酸酶 /m
10、g 酚/(g 干土24h) 1.30 1.30 1.74 1.60 蔗糖酶 /(mL Na2S2O3/g 干土) 6.86 6.70 9.00 8.53 DB22/T 30782019 5 A A 附 录 A (资料性附录) 土壤微生物数量的测定 A.1 原理 稀释平板法是测定土壤微生物数量最常用的一种方法。 土壤微生物在高度稀释条件下可以在固体平板上生长形成分散的菌落, 即一个菌落代表一个单细胞。 根据平板上的菌落数换算得到单位重量的土壤微生物数量。 A.2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: A.2.1 天平:感量为 0.01 g。 A.2.2 恒温培养箱
11、:30 1 。 A.2.3 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度) ;也可是微量移液器及吸头。 A.2.4 无菌锥形瓶:容量 500 mL。 A.2.5 无菌培养皿:直径 90 mm。 A.3 试剂 A.3.1 LB 培养基(测量细菌数量) A.3.1.1 成分 A.3.1.1.1 胰蛋白胨 10.0 g A.3.1.1.2 酵母浸粉 5.0 g A.3.1.1.3 氯化钠 10.0 g A.3.1.1.4 琼脂 20.0 g A.3.1.1.5 蒸馏水 1000 mL A.3.1.2 制法 将上述成分溶解于蒸馏水中,调节 pH 至 7.0 0.1,分装,121 高压灭菌 15 min
12、。 A.3.2 PDA 培养基(测量真菌数量) A.3.2.1 成分 A.3.2.1.1 马铃薯浸粉 6.0 g A.3.2.1.2 葡萄糖 20.0 g A.3.2.1.3 琼脂 20.0 g A.3.2.1.4 蒸馏水 1000 mL A.3.2.2 制法 DB22/T 30782019 6 将上述成分溶解于蒸馏水中,调节 pH 至 5.6 0.2,分装,121 高压灭菌 15 min。 A.3.3 高氏一号培养基(测量放线菌数量) A.3.3.1 成分 A.3.3.1.1 可溶性淀粉 20 g A.3.3.1.2 硝酸钾 1 g A.3.3.1.3 磷酸氢二钾 0.5 g A.3.3.1
13、.4 硫酸镁 0.5 g A.3.3.1.5 氯化钠 0.5 g A.3.3.1.6 硫酸亚铁 0.01 g A.3.3.1.7 琼脂 20 g A.3.3.1.8 蒸馏水 1000 mL A.3.3.2 制法 将上述成分溶解于蒸馏水中,调节 pH 至 7.3 0.1,分装,121 高压灭菌 15 min。 A.4 操作步骤 A.4.1 用天平称取 10.00 g 土样加入盛有 100 mL 无菌水的 500 mL 三角瓶中, 在振荡机上振荡 10 min,形成土壤悬液。 A.4.2 吸取 1 mL 土壤悬液到 9 mL 灭菌水中, 并在灭菌水中反复吸入吹出 3 次 5 次, 记为 10-1,
14、按 10 倍法稀释,通常稀释到 10-6。 A.4.3 根据各类微生物在土壤中数量的多少选择适当稀释的土壤悬液接种。 稀释度真菌一般为 10-3 10-1,放线菌为 10-5 10-3,细菌为 10-6 10-4,每一稀释度重复 3 次 5 次。 A.4.4 先于直径为 9 cm 的灭菌培养皿中倾注 18 mL 左右的培养基, 凝固后, 吸取 0.1 mL 某一稀释度土壤悬液于固体平板中,然后立即用涂布棒将悬液均匀涂抹于固体平板表面。 A.4.5 将培养皿倒置于恒温培养箱中 28 30 培养,培养一定时间后(细菌 2 天 3 天,真菌 3 天 5 天,放线菌 5 天 7 天) ,细菌和放线菌选
15、取出现菌落数在 20 200 的培养皿,真菌选择菌落数在 10 100的培养皿记录菌数。 A.5 结果计算 按式(A.1)计算: WnXN10= . (A.1) 式中: N 每克干土中的菌落数,单位为 cfu/g 干土; X 菌落平均数,单位为个; n 稀释倍数; W 土壤质量,单位为克(g)。 DB22/T 30782019 7 B B 附 录 B (资料性附录) 土壤微生物量碳的测定 B.1 原理 新鲜土壤经氯仿熏蒸后 (24 h) , 土壤微生物死亡细胞发生裂解, 释放出的微生物量碳通过 0.5 mol/L K2SO4 溶液提取后,用重铬酸钾-硫酸溶液进行氧化。反应结束后,用硫酸亚铁来滴
16、定剩余的重铬酸钾,根据所消耗的重铬酸钾量, 计算得到有机碳量。 根据熏蒸土壤和未熏蒸土壤测定有机碳量的差值及转换系数(kEC),从而计算土壤微生物量碳含量。 B.2 设备和材料 B.2.1 天平:感量为 0.01 g 和 0.1 mg。 B.2.2 真空干燥器:直径 22 cm。 B.2.3 聚乙烯离心管:200 mL。 B.2.4 消化管:150 mL,24 mm 295 mm。 B.2.5 冰箱:-20 和 4 。 B.2.6 水泵抽真空装置。 B.2.7 油浴消化装置:包括油浴锅和铁丝网。 B.2.8 可调温电炉:2000 1 。 B.2.9 烧杯:15 mL、25 mL B.2.10
17、聚乙烯离心管:80 mL B.3 试剂 B.3.1 无乙醇氯仿(CHCl3) 普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂, 使用前需除去。 将氯仿试剂与蒸馏水按 1:2 (体积比)一起放入分液漏斗中,充分摇动 1 min,慢慢放出底层氯仿于烧杯中,重复洗涤 3 次。得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙,以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中,避光保存于 4 冰箱中。注意氯仿具有致癌作用,必须在通风橱中进行操作。 B.3.2 硫酸钾(0.5 mol/L)溶液 称取硫酸钾(K2SO4)87.10 g 溶于蒸馏水中,稀释至 1000 mL。 B.3.3 重铬酸钾(0.2000 mol/L)标准溶液
18、称取经 130 烘干的重铬酸钾(K2Cr2O7,分析纯)9.8110 g 溶于蒸馏水中,稀释至 1000 mL。 B.3.4 重铬酸钾(0.1000 mol/L)标准溶液 称取经 130 烘干的重铬酸钾(K2Cr2O7,分析纯)4.9055 g 溶于蒸馏水中,稀释至 1000 mL。 DB22/T 30782019 8 B.3.5 硫酸亚铁(0.05 mol/L)溶液 称取 13.9005 g 硫酸亚铁(FeSO47H2O,化学纯)溶于 800 mL 蒸馏水中,慢慢加入浓硫酸 5 mL,在用蒸馏水稀释至 1000 mL,保存于棕色试剂瓶中。 此溶液易被空气氧化,需在每次使用前进行标定。标定方法
19、:吸取 0.1000 mol/L 标准溶液 5.0 mL于 150 mL 三角瓶中,加 5 mL 浓硫酸和 2 滴邻啡啰啉指示剂,用硫酸亚铁溶液滴定至终点,根据所消耗的硫酸亚铁溶液量计算其准确浓度, 按式(B.1)计算: 21VVCM=. (B.1) 式中: M 硫酸亚铁标准溶液浓度,单位为摩尔每升(mol/L); C 重铬酸钾标准溶液浓度,单位为摩尔每升(mol/L); 1V 吸取的重铬酸钾标准溶液体积,单位为毫升(mL); 2V 滴到终点时消耗硫酸亚铁溶液体积,单位为毫升(mL)。 B.3.6 邻啡啰啉指示剂 称取 1.49 g 邻啡啰啉溶于 100 mL 0.7% 分析纯硫酸亚铁溶液。密
20、封保存于棕色试剂瓶中。 B.4 操作步骤 B.4.1 熏蒸 B.4.1.1 称取过 2 mm 筛的新鲜土壤 20.0 g 于 25 mL 烧杯中, 置于真空干燥器中, 同时一并放置盛有 50 mL 无乙醇氯仿的烧杯(烧杯内放入少量防爆沸玻璃珠)和盛有 50 mL NaOH 溶液的烧杯(NaOH 用以吸收熏蒸过程中释放出来的 CO2) ,干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子,用真空泵抽真空,使氯仿沸腾 5 min。关闭真空干燥器的阀门,于 25 黑暗条件下培养 24 h。 B.4.1.2 熏蒸结束后,打开真空干燥器阀门(应听到空气进入的声音,否则熏蒸不完全) ,取出盛有氯仿(可
21、重复利用)和 NaOH 溶液的小烧杯,清洁干燥器,反复抽真空(5 次或 6 次,每次 3 min,每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子) ,直至土壤无氯仿气味为止。同时,另称等量的 3 份土壤置于另一个干燥器中,作为不熏蒸对照处理。 B.4.1.3 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土壤,将土壤完全转移到 200 mL 聚乙烯离心管中,加入 80 mL 0.5 mol/L 硫酸钾溶液,300 r/min 振荡 30 min,用中速定量滤纸过滤。同时做 3 个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析,或 -20 冷冻保存。 B.4.2 测定 吸取上述 10 mL 土壤提取液于 150 mL 消化管中,加入
22、5 mL 重铬酸钾溶液(0.2000 mol/L)、浓硫酸 5 mL,再加入 3 片或 4 片经浓盐酸浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片(以防瀑),混匀后置于油浴消化装置中煮沸 10 min。冷却后转移到 150 mL三角瓶中,用去离子水洗涤消化管 3 次 5 次使溶液体积约为 70 mL,加入 2 滴邻啡啰啉指示剂,用 0.05 mol/L 硫酸亚铁标准溶液滴定,溶液颜色由橙黄色变化为蓝绿色,再变为棕红色即滴定终点。 DB22/T 30782019 9 B.5 结果计算 B.5.1 有机碳量 有机碳量按式(B.2)计算: ()WfMVVA=031012. (B.2) 式中: A有机碳量,单位为毫克每千
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