DB32∕T 3775-2020 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法.docx
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1、ICS65.020.20B 31DB32江苏省地方标准DB 32/ T 37752020猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法 RT-LAMP method for Detectiong Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus2020 - 04 - 08发布2020 - 05 - 15实施江苏省市场监督管理局发布目 次前言1 范围12 规范性引用文件13 缩略语14 原理15 试剂和仪器设备26 操作程序27 结果判定48 安全和防污染措施4附录A (规范性附录) 试剂的配制5附录B (资料性附录)6前言本标准按照GB/T
2、1.12009给出的规则起草。本标准由南京农业大学提出并归口。本标准起草单位:南京农业大学。本标准主要起草人:姜平、张日腾、白娟、熊富强、王先炜、李玉峰、陈闻。猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法1 范围本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测原理、试剂和仪器设备、检测程序和结果判定。本标准适用于猪临床样品(肺脏、脾脏和血清)和细胞培养物中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测;同时适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒经典型、高致病性、类NADC30型三种基因亚型的分型检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日
3、期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改版)适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫。NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范SN/T1193 基因检验实验室技术要求3 缩略语PRRSV: porcine reproductive and respiratory syndrome virus,猪繁殖与呼吸综合征病毒LAMP:loop-mediated isothermal amplification, 环介导的恒温扩增RT-LAMP:Reverse transcription, loop-mediated isothe
4、rmal amplification,反转录环介导的恒温扩增。4 原理猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要引起猪繁殖与呼吸综合征 (俗称蓝耳病)。该病毒有美洲型和欧洲型两个血清型。美洲型又有多个基因亚型。我国流行的美洲型PRRSV主要有传统型、高致病性和类NADC30型毒株,其主要区别存在于病毒的Nsp2基因。环介导的恒温扩增(LAMP)是一种体外恒温核酸扩增技术,用于快速检测DNA。RT-LAMP是一种逆转录LAMP,用于检测RNA。本标准RT-LAMP,根据PRRSV开放阅读框架7(ORF7)基因序列、ORF1a(非结构蛋白Nsp2)基因序列设计4组引物,建立4种RT-LAMP检测方法
5、(即LAMP1、LAMP2、LAMP3和LAMP4),其中LAMP1的特异性引物识别ORF7基因,LAMP2、LAMP3和LAMP4的特异性引物识别Nsp2基因。每种LAMP引物均包括两对内、外引物(内引物FIP与BIP,外引物F3与B3)和一对环引物(LF与LB)。利用Bst酶启动循环链置换反应,启动互补链合成,通过在同一链上互补序列周而复始形成有很多环状结构的茎环DNA混合物,在恒温条件下完成核酸扩增反应。从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产生副产物(焦磷酸镁)形成白色沉淀,加入显色液,即可通过颜色变化观察判定结果。该检测方法简便快速、敏感特异,不需要昂贵的仪器设备。
6、5 试剂和仪器设备5.1 试剂要求除有特殊说明外,所有生化试剂均为分析纯。RNA提取相关试剂或用品均需经无RNA酶处理。5.2 引物PRRSV LAMP检测引物和PRRSV毒株基因亚型鉴别LAMP引物,人工合成(基因序列见附录B.1)。5.3 通用试剂裂解液(TRIZOL);氯仿;0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2)(见附录A.1);DEPC处理水(见附录A.2);异丙醇;75%乙醇;耐热M-MLV(RNase H-)反转录酶;pMD18-T载体;胶回收试剂盒(Qiagen);质粒DNA提取试剂盒(TaKaRa);PCR试剂(Promega)。5.4 LAMP试剂10Bst
7、DNA 聚合酶缓冲液(见附录A.3); 100 mmol/L MgSO4; 10 mmol/L dNTPs (dATP,dCTP ,dTTP,dGTP); 8 U/L Bst DNA 聚合酶; 5 mol/L 甜菜碱(Betaine); 灭菌双蒸水。 SYBR Green I 染料,1000。5.5 阴性及阳性对照5.5.1 阴性对照pMD18-T空载体质粒。5.5.2 阳性对照LAMP1阳性对照为pMD-BB-N质粒(含高致病性PRRSV BB0907毒株ORF7基因);LAMP2阳性对照为pMD-S1-Nsp2质粒(含传统型PRRSV S1毒株Nsp2基因);LAMP3阳性对照为pMD-B
8、B-Nsp2质粒(含高致病性PRRSV BB0907毒株Nsp2基因);LAMP4阳性对照为pMD-FJ-Nsp2 质粒(含类NADC30 PRRSV FJ1402毒株Nsp2基因)。5.6 仪器高速冷冻离心机,恒温水浴锅,微量移液器(0.5 L10 L、20 L200 L、100 L1 000 L),PCR仪,EP反应管(0.5 mL、1.5 mL),组织匀浆器或研钵。6 检测程序6.1 样品处理按照NY/T 541动物疫病实验室检验采样方法,采集待检猪的肺脏、脾脏和血清等样品。肺脏、脾脏取约1g,剪碎后按1:3(V/V)加入PBS(0.01mol/L,pH7.2),充分匀浆呈悬液。血清制备
9、方法为:血液(不加抗凝剂)室温静置2 h 3 h后,4000 r/min离心5 min,取上清液置于EP管内。处理好的匀浆悬液和血清于-20 保存备用。 样品RNA制备按照经验证的RNA提取方法或等效的商品化RNA提取试剂盒,按照其使用说明操作。提取的RNA应在2 h内进行反转录或放置于-20保存备用。6.2 反转录(cDNA的合成)配制反转录反应体系19 L,含M-MLV 5Reaction buffer(含Mg2+) 4 L;2.5 mol/L dNTPs 1 L;Olige(dT)1L,RNA酶抑制剂 0.5 L;DEPC ddH2O 5.5L, RNA 7 L,70水浴5 min后置冰
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