DB51∕T 1828-2014 牦牛源沙门氏菌PCR检测技术规范(四川省).pdf
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1、 ICS 65.020.30 B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 18282014 牦牛源沙门氏菌 PCR 检测技术规范 2014 - 09 - 19 发布 2014 - 10 - 01 实施四川省质量技术监督局 发 布 DB51/T 18282014 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 设备和试剂 . 1 5 DNA 提取. 2 6 PCR 扩增. 3 7 PCR 产物的电泳检测. 3 8 结果判定 . 3 9 废弃物处理 . 3 附录 A(规范性附录) 相关试剂配制. 4 DB51/T 18282014 II
2、 前 言 本标准附录A为规范性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位:西南民族大学。 本标准主要起草人:张焕容、汤承、岳华、杨发龙、王永、张斌、任玉鹏、王远微。DB51/T 18282014 1 牦牛源沙门氏菌 PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了牦牛源沙门氏菌的PCR检测方法。 本标准适用于牦牛源沙门氏菌的检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室
3、用水规格和试验方法。 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程。 兽医实验室生物安全技术管理规范(2003农业部公告第302号)。 3 术语和定义 本标准采用下列术语和定义。 3.1 沙门氏菌属 salmonella 是一群寄生于人和动物肠道内的革兰阴性杆菌,生化特性和抗原结构相似,兼性厌氧。绝大多数发酵葡萄糖产酸产气,也偶尔有不产气的。在三糖铁琼脂上常产生 H2S。 3.2 牦牛源沙门氏菌 salmonella in Yak 是指从牦牛实质器官、粪便和肉品中分离鉴定的沙门氏菌,包括致病性和非致病性沙门氏菌。致病性沙门氏菌常引起犊牦牛副伤寒, 犊牦牛或青年牦牛急性胃肠炎和败血症
4、及其他组织局部炎症。 且为人类食物中毒的主要病原之一。 4 设备和试剂 4.1 主要仪器和设备 4.1.1 PCR 扩增仪 4.1.2 电泳仪、水平电泳槽 4.1.3 凝胶成像系统 4.1.4 冷冻高速离心机 4.1.5 微量高速离心机(适合于对 PCR 反应管进行离心操作) 4.1.6 高压灭菌锅 DB51/T 18282014 2 4.1.7 恒温水浴锅 4.1.8 移液器(0.1 L10 L、2 L20 L、20 L200 L、200 L1000 L) 4.2 主要试剂 4.2.1 引物(10 mol/L) 上游引物:5-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3; 下游引
5、物:5-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3。 引物扩增片段大小为 284 bp。 4.2.2 DNA 提取试剂:蛋白酶 K、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris 饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇。 4.2.3 PCR 反应试剂: Taq DNA 聚合酶 (5 U/L) 、 MgCl2 (25 mmol/L) 、 dNTP (每种浓度为 2.5 mmol/L) 、10PCR Buffer(无 Mg2+)。 4.2.4 STE 缓冲液(见附录 A) 4.2.5 TAE 电泳缓冲液(见附录 A) 4.2.6 6上样缓冲液(6Loading Buffer) 4.2.7 琼脂糖(电泳级) 4.
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