SN∕T 5656-2023 食品中5种杂粮成分定性检测方法 实时荧光PCR法.pdf
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1、I C S6 7.0 5 0C C S X0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 6 5 62 0 2 3 食品中5种杂粮成分定性检测方法实时荧光P C R法Q u a l i t a t i v e d e t e c t i o n m e t h o d o f f i v e k i n d s o f c o a r s e c e r e a l s i n f o o dR e a l-t i m e f l u o r e s c e n c e P C R m e t h o d2 0 2 3-1 1-0 1发布2 0 2 4-0 5-0 1实施中华人民共和国
2、海关总署发 布前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国大连海关、中华人民共和国成都海关、大连民族大学、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国天津海关。本文件主要起草人:杨爱馥、万超、白景莲、梁冰、胡江涛、郑秋月、田卓、孙骥扬、徐君怡、姚丽锋、蔡一村、邱向锋、刘雪华、姜丽、徐杨、林华、马兴、李雪梅、高世光、王琦。S N/T5 6 5 62 0 2 3食
3、品中5种杂粮成分定性检测方法实时荧光P C R法1 范围 本文件规定了食品中菰米(包括中国菰Z i n a n i a l a t i f o l i a、水生菰 Z.a q u a t i c a、沼生菰 Z.p a l u s-t r i s和德克萨斯菰 Z.t e x a n a)、鹰嘴豆(C i c e r a r i e t i n u m)、奇亚籽(S a l v i a h i s p a n i c a)、藜麦(C h e n o p o-d i u m q u i n o a,包括白藜麦、黑藜麦、红藜麦)和薏苡仁(C o i x l a c r y m a-j o b i)源
4、性成分的实时荧光P C R检测方法。本文件适用于食品中菰米、鹰嘴豆、奇亚籽、藜麦和薏苡仁源性成分的定性检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语和定义 下列术语和定义适应于本文件。3.1菰米 w i l d r i c e禾本科菰属植物的颖果。注1:属于全谷物,具有极高的营养价值。
5、注2:菰属植物有4种,包括中国菰、水生菰、沼生菰和德克萨斯菰。注3:本文件中菰米源性成分即指中国菰、水生菰、沼生菰、德克萨斯菰的特异性D NA片段。3.2鹰嘴豆 c h i c k p e a豆科鹰嘴豆属植物。注1:起源于亚洲西部和近东地区。注2:本文件中鹰嘴豆源性成分即指栽培种鹰嘴豆的特异性D NA片段。3.3奇亚籽 c h i a s e e d唇形科鼠尾草属芡欧鼠尾草的种子。注1:原产地为墨西哥南部和危地马拉等北美洲地区,具有极高的营养价值。注2:本文件中奇亚籽源性成分即指芡欧鼠尾草种子的特异性D NA片段。1S N/T5 6 5 62 0 2 33.4藜麦 q u i n o a藜科藜
6、属植物。注1:藜麦种子颜色主要有白、黑、红等颜色。注2:本文件中藜麦源性成分即指白藜麦、黑藜麦、红藜麦的特异性D NA片段。3.5薏苡仁 c o i x s e e d薏苡的干燥成熟种仁。注1:又名薏米、苡米、苡仁等,是禾本科薏苡属植物。注2:本文件中薏苡仁源性成分即指栽培种薏苡的特异性D NA片段。3.6实时荧光P C R r e a l-t i m e f l u o r e s c e n c e P C R 在P C R反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个P C R扩增过程。3.7C t值 c y c l e t h r e s h o l d 每个反应管内的荧光信号
7、达到设定的域值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适应于本文件。C I A-2:叶绿体介导体2基因(c h l o r o p l a s t i m p o r t a p p a r a t u s-2 g e n e)C T A B:十六烷基三甲基溴化铵(c e t y l t r i t h y l a mm o n i u m b r o m i d e)D NA:脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u l e i c a c i d)d NT P:脱氧核苷酸三磷酸(d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h
8、o s p h a t e)I T S:核糖体内转录间隔区(i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e)O D:光密度值(o p t i c a l d e n s i t y)P C R:聚合酶链式反应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n)S A D:硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶(s t e a r o y l-a c y l-c a r r i e r p r o t e i n d e s a t u r a s e)T a q D NA 聚合酶:耐热D NA聚合酶(T a q D
9、 NA p o l y m e r a s e)T r i s:三(羟甲基)氨基甲烷t r i s(h y d r o x y m e t h y l)a m i n o m e t h a n e t r n L-t r n F:t r n L基因和t r n L-t r n F基 因间隔区序列(t R NA-L e u g e n e a n d t r n L-t r n F i n t e r g e n i c s p a c e r)1 8 S r R NA:真核生物核糖体小亚基1 8 S基因(1 8 S r i b o s o m a l R NA)5 方法提要 样品经研磨后,提
10、取D NA,分别采用菰米、鹰嘴豆、奇亚籽、藜麦和薏苡仁基因序列的特异性引物和探针对样品D NA进行T a qM a n实时荧光P C R扩增,根据C t值,判断该样品中是否存在菰米、鹰嘴豆、奇亚籽、藜麦或薏苡仁成分。6 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合G B/T 6 6 8 2中一级水的规格。所有试2S N/T5 6 5 62 0 2 3剂均用无D NA酶污染的容器分装。6.1 实时荧光P C R扩增引物和探针序列见表1。菰米、鹰嘴豆、奇亚籽、藜麦和薏苡仁引物扩增的靶标序列见附录A。表1 实时荧光P C R扩增引物和探针序列信息表名称引物/探针序列(5-3)目的
11、基因内参照5 端引物内参照3 端引物内参照探针T C T G C C C TA T C AA C T T T C GA T G G TAAA T T T G C G C G C C T G C T G C C T T C C T TF AM-C C G T T T C T C AG G C T C C C T C T C C G GAA T C GAA C-TAMR A真核生物1 8 S r R NA基因 菰米5 端引物 菰米3 端引物 菰米探针C GAGAG T C G T G T G GA T G T T G TT G C G GAAG GA T C A T T G T C G TF AM
12、-C G G C G G T C G G TAAGAG G T G T T C C-TAMR A I T S基因 鹰嘴豆5 端引物 鹰嘴豆3 端引物 鹰嘴豆探针AGAAGAAG G T T G T TA C G G T G GAGC G G T G C G T C G GAGA TAG GAF AM-GAAG G C G T T C G GAA T G C T T G G T C T GA TAAA-TAMR AC I A-2基因 奇亚籽5 端引物 奇亚籽3 端引物 奇亚籽探针A T TAA TAA T GA C TAA T G T T GA C C C CGA T GAA TA T T C
13、GA T T TA T T C T T C AA C AF AM-C T G T T T T T TAA TA T GAA AA+T G GA AAA A T C GA+T G+T G-TAMR At r n L-t r n F基因 藜麦5 端引物 藜麦3 端引物 藜麦探针C A C AAG T C T T G T GA TA TA TA TA T GA T TAG A C AAAG T C T TA TA T G C G TA C C AGAA T TV I C-TAA TA T GAA T T G T GAA T C A C TAAA C T GAG TA C C C-TAMR At r
14、n L-t r n F基因 薏苡仁5 端引物 薏苡仁3 端引物 薏苡仁探针G T C T G G GAG C A T T T T G C T T G CT C C A T G T C C A C G C C C AG T T CV I C-T C T C A TAGAG T GA TAG GAGAA T G T C C G T C T G T G T T C-TAMR A S A D基因 注:+代表锁核酸(L NA)6.2 C T A B 缓冲液:5 5 mm o l/L C TA B,1 4 0 0 mm o l/L N a C l,2 0 mm o l/L E D TA,1 0 0 mm
15、o l/L T r i s,调p H至8.0,1 2 1 高压灭菌2 0 m i n,备用。6.3 T E缓冲液(T r i s-C l、E D TA缓冲液):1 0 mm o l/L T r i s-HC l(p H 8.0),1 mm o l/L E D TA(p H 8.0)。6.4 蛋白酶K:2 0 m g/L。6.5 T r i s饱和酚。6.6 三氯甲烷。6.7 异戊醇。6.8 异丙醇。6.9 7 0%乙醇。6.1 0 实时荧光P C R反应混合液:1 2.5 L反应体系包括1 U3 U的T a q酶、1P C R缓冲液、2.5 n m o l/L4.0 n m o l/L的M g
16、2+、0.2 n m o l/L d NT P。注:如果具有等效的商品化试剂盒,也能使用等效产品。3S N/T5 6 5 62 0 2 37 仪器和设备7.1 实时荧光P C R仪。7.2 离心机:转速1 2 0 0 0 r/m i n。7.3 不同量程移液器:0.5 L 1 0 L、1 0 L 1 0 0 L、2 0 L 2 0 0 L、1 0 0 L 1 0 0 0 L。7.4 冰箱:2 8,-2 0。7.5 高压灭菌器。7.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.7 p H计。7.8 天平:感量0.0 1 g。7.9 恒温水浴锅。7.1 0 涡旋振荡器。7.1 1 研钵及粉碎装置。8 检
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