NY∕T 3073-2017 家畜魏氏梭菌病诊断技术(农业).pdf
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1、ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/ T 3073一2017家畜魏氏梭菌病诊断技术Diagnostic techniques for c/ostridium welchii disease of Iivestock 2017 -06-12发布2017 -10 -01实施付中华人民共和国农业部发布NY / T 3073-2017 目U吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由农业部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位:山东农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、青岛康大集团公司。本标准主要起
2、草人:柴同杰、李卫华、郭梦娇、蔡玉梅、韦良孟、王海荣、马连营、李明勇、刘曼。I NY/T 3073-2017 家畜魏氏梭菌病诊断技术1 范围本标准规定了家畜魏氏梭菌病的诊断技术。本标准适用于家畜魏氏梭菌病的临床诊断、实验室诊断、检验检疫、监测及流行病学调查等。2 临床诊断2. 1 牛魏氏梭菌病2. 1. 1 牛魏氏梭菌病主要由D型、E型产气英膜梭菌感染引起。2. 1. 2 不同年龄、不同品种的牛(黄牛、奶牛、水牛等)均可感染发病,且四季均可发生。发病黄牛、棋牛多为体格强壮、瞟情较好者,奶牛多为高产牛。病程长短不一,短则数分钟至数小时,长则3d4 d或更长;有的呈跳跃式发生。2. 1.3 临床表
3、现为突然不安、呼吸困难。最急性型病例无任何前驱症状,倒地死亡,有的在使役中或使役后突然死亡。2. 1.4 急性型病牛体温升高或正常,呼吸急促,精神沉郁或狂躁不安,全身肌肉震颤、抽擂,行走不稳,口流白沫,最后倒地而死。2. 1.5 亚急性型呈阵发性不安,发作时两耳竖直,两眼圆睁,表现出高度的精神紧张,后转为安静,如此周期性反复发作,最终死亡。2. 1. 6 急性和亚急性病牛有的发生腹泻,虹门排出含有多量黠液、色呈酱红色并带有血腥异臭的粪便,有的排粪呈喷射状水样。2. 1.7 病理变化以全身实质器官出血和小肠出血为主要特征,肠道服气。2. 2 羊魏氏梭菌病2.2. 1 羊魏氏梭菌病主要由D型、B型
4、产气英膜梭菌感染引起。2.2.2 不同品种(小尾寒羊、黑山羊、奶山羊、绵羊、卡拉库尔羊等)、不同年龄的羊均可感染发病,一年四季均可发生,但以春秋多发,尤其是天气骤变、气温突然下降时。2. 2. 3 一般都是急性发作,病羊磨牙流涎,排带蒙古液粪便,有的为黠液性黑色混血稀粪。死后不久,腹部迅速膨大,口鼻常有白色或带血泡沫流出。2. 2. 4 病理变化为整个肠道黠膜充血,特别是小肠充血、出血、黠膜脱落;胃黠膜脱落,有出血性炎症;肾变软(肾廉烂),稍加触压即溃烂,水冲洗后,肾表面呈绒毛状。2. 3 猪魏氏梭菌病2. 3. 1 猪魏氏梭菌病主要由A型、C型产气英膜梭菌感染引起,称猪梭菌性肠炎、猪传染性坏
5、死性肠炎、仔猪红摘等。2.3.2 该病病程短,死亡快,死亡率高,一旦流行会导致大批仔猪死亡,但年龄稍大的猪造成死亡的少见。2.3.3 主要临床症状为腹泻、粪便呈红褐色,粪便有腥臭味。2. 3. 4 病理变化为肠站膜及蒙古膜下层广泛出血,肠壁呈深红色、部分肠段服气。肠壁变得薄而透明,空肠与回肠充满胶冻状液体。盲肠内有稀粪且有恶臭气体,胃黠膜脱落。2.4 家兔魏氏梭菌病1 NY/T 3073-2017 2.4. 1 家兔魏氏梭菌病主要由A型产气英膜梭菌感染引起。2. 4. 2 一年四季均可发生,但春季和由秋向冬季转变过程中、气温骤降时多发。各种年龄均可发病,断奶幼兔发病率与死亡率较高。病兔在水泻的
6、当天或次日即死亡,多为急性死亡。2. 4. 3 以急性腹泻,排黑色水样或带血胶冻样粪便。脏门周围、后肢及尾部被毛被稀粪污染。抓起病兔摇晃躯体有泼水音。2. 4. 4 病理变化为胃底霜膜脱落,并有大小不等的黑色溃殇,肠勃膜呈弥漫性充血或出血,小肠充有气体,肠壁变薄,盲肠和结肠内充满气体和黑绿色稀粪便,有腐败臭味,膀脱积有茶色尿液。-噩雪哩!I.fta2. 5 结果判定根据动物表现出的上述临3 产气英膜梭菌的分离接种环取3观察菌落形态,将厌氧培养24h分臭味,菌落颜色由3.5 产气英膜梭菌纯培挑取疑似菌落,涂3. 6 生化鉴定. 对葡萄糖、麦芽糖、煎糖、果糖、乳糖、不糖圃圃防T、呵|喋试验、HzS
7、试验、MR、还原性硝酸盐试验、明胶液化进行试验。把分离株菌液加人生化反应发酵管中,庆氧培养24h,观察生化试验结果。3. 1. 1 仪器光学显微镜法见A.2)、3.2 涂片、采取清氏染色反应野中革兰元菌儿异MG有养勒后培时出氧翻眼/A# 养3.7 牛乳培养基进行暴烈发酵试验该菌能使牛奶培养基暴烈发酵。3.8 结果判定TSC培养基上可疑菌落为黑(玄)色;血平板上可疑菌落双溶血环,平板从培养箱取出后,菌落颜色由灰褐变为绿色。生化反应是葡萄糖+、麦芽糖十、煎糖十、果糖一、乳糖+ 、木糖、甘露醇一、水杨昔一、呵|睐试验一、HzS试验+、MR+、还原性硝酸盐试验十、明胶液化+,以及牛奶培养基暴烈发酵的分
8、离株可判定为产气英膜梭菌。4 产气英膜梭菌毒素基因的PCR检测4.1 材料准备4. 1. 1 仪器NY/T 3073-2017 厌氧培养箱、超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、数显恒温水浴锅、振荡器、离心机、高压灭菌锅。4.1.2 培养基和试剂血琼脂平板、增菌培养基、Taq酶、DNA模板、dNTPs、双蒸水。4.2 引物根据产气英膜梭菌4种主要毒素基因序列和国内外公开发表的引物序列合成通用引物(见表1)。基因,bp(a!pha)cpa(325) (beta)cpbCl96) E(epsi!on) etx( 656) (iota) iap( 446) 4.3 DNA模板的制备4. 3. 1
9、 增菌表1引物序列上游引物(5-3) 下游引物(5-3) GCTAATGTTACTGCCG寸GACCTCTGATACATCGTGTAAG GCGAATATGCTGAATCATCTA GCAGGAACATTAGTATATCTTC GCGGTGATATCCATCTAl寸CCCACTTACI寸GTCCTACTAACACTACTCTCAGACAAGACAG c寸TCCTTCTA1寸ACTATACG将第3章分离鉴定的产气英膜梭菌接种于营养肉汤培养基中,430C庆氧培养12h。4. 3. 2 模极制备取增菌培养物于1mL离心管中,8000g离心1.5 min2 min,弃去上清,加人100LTE(配制方法
10、见附录B中的B.1)混匀作为模板。4.4 PCR反应体系(25L)4.4.1 PCR反应体系10 X Taq buffer(含Mg2+)dNTPs 上游和下游引物(10pmol/L) 模板无菌双蒸水Taq DNA聚合酶4. 4. 2 对照2. 5L 2. 5L 各1L2L 15. 75L O. 25L 同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照,用B型(NCTC8533)、E型(NCTC8084)产气英膜梭菌标准菌株的菌体做阳性对照,用大肠杆菌标准菌株的菌体做阴性对照,用无菌双蒸水做空白对照。4.5 PCR反应940C变性5min,然后30个循环,分别为:940C变性30s;530C退火30s; 7
11、20C延伸1mino最后720C延伸10min,40C保存。4. 6 电泳用TAE(配制方法见B.2)制备1%琼脂糖凝胶,加样6L8L,在电压80V100 V、电流40mA下进行电泳30min40 min。4. 7 结果判定用凝胶成像仪观察扩增条带,在阴性对照和空白对照泳道无条带,阳性对照泳道出现325bp、日196NY/T 3073-2017 bp、.:656bp、446bp的清晰条带的条件下,根据阳性条带大小判断样品阳性或者阴性(参见附录c)。5 产气英膜梭菌毒素型的ELISA鉴定5. 1 仪器、材料准备5. 1. 1 仪器酶标仪、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、庆氧培养箱、恒温箱、9
12、6孔高吸附性酶标板、洗瓶或者洗板机。5. 1.2 培养基和试剂5.2. 1 检测样品5. 2. 1. 1 复苏将第35.4 ELISA检测毒素5.4. 1 包被抗体将适量稀释的标准血8.C静置12 h)。5.4.2 冲洗、抗D-酶标抗体、包被液D.3)、封闭液(配制方法见,一20.C抗c-板和抗D-板包被液甩掉,用PBST缓冲液再加满,重复5次,然后在纤维纸上轻扣,将孔隙中剩余水洗液彻底除掉。5. 4. 3 封闭每孔200L封闭液,3 7C温浴3h(或4.C8.C静置12h),封闭后的微量反应板可在20.C下长时间保存。5. 4. 4 样晶稀释用PBS将毒素稀释为2.0%2. 5%06L样品十
13、784LPBS或20L样品+780LPBS)。5. 4. 5 样晶中和NY/T 3073-2017 用抗C血清和抗0-血清包被的反应板的A+B孔各加入100L样品稀释液(5.4.4)(每个样品稀释液总量为800L)。将每个样品稀释液剩余的600L(用于抗c-板的)加人抗0-血清(异系中和),再各取100L分别加入c+o孔中。其次400L加8L抗C血清(同系或全部中和),同样各取100L加人E十F孔中。用于抗0-血清板的每个样品毒素的异系中和及同系中和分别采用9L抗C一血清和4L抗D一血清,其他步骤同抗C-板。20s振摇(250次/min)后用铝纸罩好,在室温下1h放置,然后同上水洗。5. 4.
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