WS∕T 633-2018 巴贝虫检测 虫种核酸鉴定法(卫生).pdf
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1、ICS 11.020C 61WS中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准WS/T 6332018巴贝虫检测 虫种核酸鉴定法Detection of Babesia spp.Identification of species by nucleic acid method2018 - 09 - 26 发布2019 - 04 - 01 实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发 布WS/T 6332018I前言本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由国家卫生标准委员会寄生虫病标准专业委员会提出。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、复旦大学、第二军医大学
2、。本标准起草人:刘琴、周晓农、张仪、胡薇、陈家旭、朱淮民。WS/T 63320181巴贝虫检测虫种核酸鉴定法1范围本标准规定了检测巴贝虫的虫种核酸鉴定法。本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。WS/T 564巴贝虫病诊断3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1巴贝虫 Babesia spp.一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫,可引起巴贝虫病(babesiosis)。感染人体的巴贝虫种类主要有
3、田鼠巴贝虫 (Babesia microti)、分歧巴贝虫(B. divergens)、邓肯巴贝虫(B. duncani)和猎户巴贝虫(B. venatorum)等(参见附录A)。4仪器和器材4.1高速离心机最大相对离心力为 12 000g。4.2涡旋仪无级调速范围为 200 r/min3 000 r/min。4.3PCR 扩增仪温度范围为 499 ,温度精确为 0.1 ,热盖为 105 。4.4微波炉4.5电泳仪电压为 5 V5 000 V,电流为 1 mA500 mA。WS/T 633201824.6凝胶成像系统镜头分辨率(H V)为 1 360 1 024,光源为透射 UV。5试剂和材料
4、5.1分子生物学试剂Taq 酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、分子质量指示物及核酸提取试剂盒选用商品化产品。5.2化学试剂Tris-乙酸电泳缓冲液(TAE)、琼脂糖凝胶、6加样缓冲液(参见附录B)。5.3引物扩增巴贝虫 18S 核糖体RNA (18S rRNA)基因和转录间隔区(ITS)基因的特异性引物(见附录C)。5.4参照材料阳性对照为田鼠巴贝虫 peabody mjr 株基因组 DNA。空白对照为去离子灭菌水。阴性对照为健康人全血基因组DNA。6检测步骤6.1样品样品为临床诊断或疑似巴贝虫病病例抗凝血样品。6.2虫种核酸鉴定6.2.1核酸提取基因组DNA提取采用商品化全血DNA提取试
5、剂盒(参见附录 B)。6.2.218S rRNA 基因扩增见附录 C。6.2.3ITS 基因扩增见附录 C。6.2.4结果判定6.2.4.1电泳分析6.2.4.1.1电泳WS/T 63320183取第二轮PCR产物 5 L与 1 L 6加样缓冲液混合, 加样于含溴化乙锭替代物的 1.0琼脂糖凝胶中,在1TAE 缓冲液中,5 V/cm 电泳约 40 min,当溴酚蓝到达底部时停止电泳,用凝胶成像系统或紫外分析仪分析。6.2.4.1.2PCR 结果判断6.2.4.1.2.1 PCR 扩增巴贝虫 18S rRNA 基因,出现大小为 400 bp 左右特异性的扩增片段,空白对照和阴性对照未出现条带,
6、PCR 结果阳性。 PCR 扩增巴贝虫 18S rRNA 基因, 未出现大小为 400 bp 左右特异性的扩增片段,空白对照和阴性对照未出现条带,PCR 结果阴性。6.2.4.1.2.2 PCR 扩增巴贝虫 ITS 基因,出现大小在 700 bp2 100 bp 的特异性的扩增片段,空白对照和阴性对照未出现条带,PCR 结果阳性。PCR 扩增巴贝虫 ITS 基因,未出现特异性的扩增片段,空白对照和阴性对照未出现条带,PCR 结果阴性。6.2.4.2测序分析阳性 PCR 扩增产物进行双向测序,将序列进行 BLAST 比对分析(见附录 C)。6.2.4.3虫种鉴定根据PCR扩增产物电泳结果与测序结
7、果分析,综合判定虫种种类(见附录C)。WS/T 63320184AA附录A(资料性附录)病原生物学A.1分类巴贝虫(Babesia spp.)属于顶复门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoa)、梨形虫亚纲(Piroplasmasina)、梨形虫目(Piroplasmida)、巴贝虫科(Babesiidae)的巴贝虫属(Babesia)。目前已鉴定的有100多种巴贝虫,可以感染牛、马、羊、犬等多种哺乳动物和鸟类。在100多种巴贝虫中,既往已知可以感染人的巴贝虫种类主要有:田鼠巴贝虫(B. microti)、分歧巴贝虫(B. divergens)、邓肯巴贝虫(B. duncani,
8、也称为WA1)和猎户巴贝虫(B. venatorum,也被称为EU1)等。不同巴贝虫虫种引起人体临床症状的比较见表A.1。A.2分布本病呈地方性流行。在美国,巴贝虫病病例主要发现于马萨诸赛岛、纽约州、康涅狄格岛、加利福尼亚州以及罗得岛。在欧洲,法国、葡萄牙、意大利、波兰、挪威等地均有人巴贝虫病病例发生。另外,在埃及、墨西哥、澳大利亚、日本、韩国、巴基斯坦及南非也均有人巴贝虫病病例报道。在我国云南、河南、新疆、山东、陕西、浙江、江苏、广西、福建及台湾、香港地区等地均有人巴贝虫病病例报道。表 A.1不同巴贝虫虫种引起人体临床症状的比较虫种虫种地理分布地理分布媒介名称媒介名称潜伏期潜伏期临床特征临床
9、特征其他其他田鼠巴贝虫(B. microti)欧洲、 美国、日本、 中国、埃及等肩突硬蜱、卵形硬蜱、全沟硬蜱、丹敏硬蜱1周6周,甚至3个月以上大多数患者症状比较轻微,只出现一过性的发热症状;而重症患者出现疟疾样症状,包括发热、寒战、肌肉疼痛、贫血、无力、肝脾肿大、溶血性贫血等一般以50岁以上的老人易感分歧巴贝虫(B. divergens)欧洲篦子硬蜱1周3周突然起病、血红蛋白尿、黄疸、休克样表现脾脏切除和免疫缺陷者易感邓肯巴贝虫(B. duncani)欧洲、美国等丹敏硬蜱、肩突硬蜱3周2个月发热、寒战、肌肉疼痛、贫血、无力、肝脾肿大、溶血性贫血,持续数周或更长脾脏切除患者易感;易输血传播猎户巴
10、贝虫(B. venatorum)欧洲、中国等蓖子硬蜱、卵形硬蜱不明确大多数患者症状比较轻微,只出现一过性的发热症状;严重者表现贫血、血红蛋白尿、黄疸等症状免疫功能低下者或者脾切除患者易感WS/T 63320185BB附录B(资料性附录)试剂配制B.1试剂的配制B.1.1Tris-乙酸电泳缓冲液(Tris- acetic acid buffer solution,TAE)的配制50 TAE 的配制: 三 (羟甲基) 氨基甲烷 (Tris 碱) 242 g, 冰乙酸 57.1 mL, 0.5 mol/L EDTA( pH8.0) 100 mL,加去离子灭菌水定容至 1 000 mL,混匀 4保存备
11、用。B.1.21 TAE 使用液的配制50 TAE 20 mL加蒸馏水定容至 1 000 mL,混匀备用。B.1.31.0%琼脂糖凝胶的配制琼脂糖 1.0 g 加1 TAE 定容至 100 mL,微波炉加热完全融化后,溶液冷却至 60 ,加 10mg/mL 溴化乙锭替代物 5 L(终浓度0.5 g/mL),轻轻混匀后,制备凝胶。B.1.46加样缓冲液的配制溴酚蓝 0.25 g,蔗糖 40 g,加蒸馏水至 100 mL。置于 4 保存备用。B.2DNA的提取取 100 L血液样品,用商品化的全血样品DNA提取试剂盒提取基因组DNA,操作步骤按试剂盒说明书进行。WS/T 63320186CC附录C
12、(规范性附录)PCR 实验、测序结果分析及标准参考序列C.1PCR扩增引物序列巴贝虫虫种鉴定引物见表C.1。表 C.1 巴贝虫虫种鉴定引物引物引物名称引物序列a片段大小b参考文献18S rRNA外侧引物Bab 55-AATTACCCAATCCTGACACAGG-3400 bp 左右3Bab 85-TTTCGCAGTAGTTCGTCTTTAACA-318S rRNA内侧引物Bab 65-GACACAGGGAGGTAGTGACAAGA-3Bab 75-CCCAACTGCTCCTATTAACCATTAC-3ITS外侧引物ITS-F35-GGTGGTGCATGGCCG-3700 bp2 100 bp4
13、ITS-R35-T(A/T)GCGCTTCAATCCC-3ITS内侧引物ITS-F45-GAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCG-3ITS-R45-GCTTCACTCGCCGTTACTAGG-3a18S rRNA 基因引物序列和 PCR 反应引自 WS/T 564 。b不同虫种片段大小不同。C.2引物配制引物用去离子灭菌水配制成100 mol/L储备液。然后取出一部分,加入相应体积的去离子灭菌水稀释成20 mol/L的工作液备用。C.318S rRNAPCR反应体系及反应条件C.3.118S rRNA PCR第一轮反应C.3.1.1 以引物Bab 5和Bab 8进行第一轮扩增,反应体系为
14、 50 L。Taq 酶(5 U/L)0.25 L10PCR缓冲液(含15 mmol/L Mg2+)5 L25 mmol/L dNTPs4 L20 mol/L Bab 51.5 LWS/T 6332018720mol /L Bab 81.5 L基因组DNA模板(约70 ng)2 L去离子灭菌水35.75 L总计50 LPCR 反应需设立阳性、阴性和空白对照。C.3.1.2 PCR 条件95 5 min;95 45 s,55 45 s,72 1 min,共35个循环;72 7 min;4 。C.3.218S rRNA PCR第二轮反应C.3.2.1 取第一轮PCR产物2 L为模板,以引物Bab 6
15、和Bab 7进行第二轮扩增,反应体系为 50 L。Taq 酶(5 U/L)0.25 L10PCR 缓冲液(含 15 mmol/L Mg2+)5 L25 mmol/L dNTPs4 L20 mol /L Bab61.5 L20 mol /L Bab71.5 L第一轮PCR产物2 L去离子灭菌水35.75 L总计50 LC.3.2.2 PCR 条件95 5 min;94 45 s,55 45 s,72 1 min,共35个循环;72 7 min;4 。C.4ITS PCR反应体系及反应条件C.4.1ITS PCR第一轮反应C.4.1.1 以引物ITS-F3和ITS-R3进行第一轮扩增,反应体系为
16、50 L。Taq 酶(5 U/L)0.25 L10PCR 缓冲液(含15 mmol/L Mg2+)5 L25 mmol/L dNTPs4 L20 mol /L ITS-F31.5 L20 mol/L ITS-R31.5 L基因组DNA模板(约70 ng)2 L去离子灭菌水35.75 L总计50 LPCR 反应需设立阳性、阴性和空白对照。C.4.1.2 PCR条件95 5 min;94 30 s,50 30 s,72 2 min,共35个循环;72 10 min;4 。C.4.2ITS PCR第二轮反应C.4.2.1 取第一轮PCR产物 2 L为模板,以引物ITS-F4和ITS-R4进行第二轮扩
17、增,反应体系为 50 L。WS/T 63320188Taq 酶(5 U/L)0.25 L10PCR缓冲液(含15 mmol/L Mg2+)5 L25 mmol/L dNTPs4 L20 mol /L ITS-F41.5 L20 mol /L ITS-R41.5 L第一轮PCR产物2 L去离子灭菌水35.75 L总计50 LC.4.2.2PCR 条件95 5 min;94 30 s,60 30 s,72 2 min,共35个循环;72 10 min;4 。注:PCR实验符合WS/T 230的规定。C.5测序结果分析序列同源性分析利用Blastn (https:/blast.ncbi.nlm.ni
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