NY∕T 3641-2020 欧洲甜樱桃品种鉴定SSR分子标记法(农业).pdf
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1、ICS 65.020.01 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3641一2020欧洲甜樱桃品种鉴定SSR分子标记法Identification of sweet cherry varieties using SSR marker method 2020-07 -27发布2020-11-01实施中华人民共和国农业农村部发布NY / T 3641-2020 目次前言 . . . 1 l 范围2 规范性引用文伺3 术语和定义4 仪器设备及试剂5 溶液配制6 引物相关信息及使用.7 参照品种及使用8 操作程序9 数据记录与统计 . . . 3 10 判定方法. 附录A(规范性附录)仪
2、都设备及试剂附录B(规范性附录)溶液配制.附录C(规范性附录)核心寻|物名单及序列附录O(资料性IIH录核心引物相关信息. . . . 9 T NY/ T 3641-2020 11 本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC277)归口.本标准起草单位:中国农业科学院郑州果树研究所.木标准主要起草人:李明、文IJ聪利、齐希梁、李玉红、宋跟踪.NY /T 3641-2020 甜樱桃品种鉴定SSR分子标记法范围本标1(1年规定了利用简单重复序列(Simplcscqucncc rcpcat. SSR)标记的遗传多态性进行欧洲甜樱桃(Pru川LSClvium L. )品种鉴定的操作程序、
3、数据记录与统计、判定规则。本标lfI适用于欧洲!tl樱桃品和仙C曙a:. ,-jj;:噎-副.12 规范性引用文件凡是不注日期的引NY/T 2594 NY/ T 3056 3 3.1 核心引1叩门口据采集3.2 4 见附录A。5 溶液配制见附录B.6 号|物相关信息及使用唱崔核心引物名单及序列见附录C.核心可|物相关信息见附录D。7 参照晶种及使用参见I!付录D.B 操作程序8. 1 样品制备J冽的版本适用于本文件。异扩增片段每个品利1检测3个单株,进行混样分听.当一致性结果较差时,进行单独l驭样分析。8.2 DNA提取与检测采用CTAB法。选取欧洲百It樱桃%JJ嫩III片或芳(0.2g左右
4、)在液氮中liIf磨至粉末,迅速将粉末移入NY/T 3641-2020 2. 0 mL离心笆,每管如l人700L6SC预热的2%CT八B缓冲液,轻挤混匀;65C水浴30min,期间多次颠倒混匀以确保充分裂仰。于4C12000 g 离心10min; Jj5(上消液,每笆加入等体积的主主仿-异戊邸(24; 1)混合液,充分混匀后,12000g 离心10min;Jj5(上消液到新的2mL离心包中,再加人1mL -20C预冷的异丙醇,颠倒混匀沉淀DNA,并于一20C条卡|下放进30min以上,于4C12000g离心15min,弃上消液,用75%乙醉浸泡消洗沉淀2次,风干,将沉淀物溶解于200L灭菌超纯
5、水中,使用核酸蛋白浓度测定仪进行浓度测定,-20C保存备用.注.以上为Ifl荐的一种DNA提取方法.所获DNA质il能够符合ICR扩增刊,耍的DNAJM收方法部适用于本标削.8.3 PCR扩增8. 3. 1 引物选择选择附录C中17对引物进行检测.8.3.2 反应体系10L反应体系DNA1L(30 nglU、lOXPCR反应缓冲液(含Mg2+)jIL、dNTPO. 8L(2. S mmol/U、正反向可|物各O.4 /-,L(10 /-,mol/U , T.叫酶O.2L(5 Ul1L),灭菌超纯7(6. 2 IL,在PCRtf m仪上进行扭.l0 利用毛细岱也泳荧光检测时使用荧光标记的引物,寻
6、|物的荧光染料种类参见附录D。注:反应体系的体积可以根据具体的忻况进行调整.8.3.3 反应程序95C预变性5min;95C变性30s,5 7C退火305,72C延伸1min,共3 5个循环;72C下延伸10min, 4C保存。8. 4 PCR产物检测8. 4. 1 普通变性聚丙烯酸股凝胶电泳(Polyacrylamidegel electrophoresis, PAGE)检jjIJ8.4. 1. 1 清洗玻瑶板将玻璃板m洗干净,用去离子水冲洗后l琼干。用无7(乙醉擦洗2遍,1吸水纸擦干。在长板上涂0. 5 mL亲和l硅炕工作液,带凹拙的短板上涂0.5mL剥离fili炕工作液。操作过程中防止2
7、块破硝板互相污染。8.4. 1.2 组装电泳板待玻璃板彻底干燥后组装电泳板,井,用水平仪调平。8.4. 1.3 制胶在60mL 6.0% PAGE 1.庶液中分别!JII人600L10%的过硫股锁和60IL TEMED,轻轻混匀后,泌胶。illiJJ!l过程中防止:J.:现气泡。待j皮液完全充满玻璃板夹层,将0.4mm厚EE鱼齿梳齿平齐揣向监轻轻插入j皮液约0.4cm, J皮液在室,下聚合1h以上。J皮聚合后,清理胶板表面淄川的胶液,轻轻拔11梳子,用水清洗干净备用.8. 4. 1. 4 预电泳将胶极安装于电泳棚上,在正极扭lj(下;ft)中加入lXTBE缓冲液约800mL,在负极槽(上档)力
8、11人预热至65C的lXTBE缓冲液约800mL,在85W恒功率下,Ij电泳10min20 min, 8.4. 1.5 样品制备在10LPCR产物中加入2L6X力11样缓冲液,混匀后,在PCR仪上95C变性5min,l仅:l,迅速宜于冰上.8. 4. 1. 6 电泳用移液都l次l以力u样棚,消除气泡平ql杂质。将注鱼齿梳子梳岱端fif入凝胶1mm2 mm,每一个1JII样孔点人2LIL扩增产物,在胶极两侧点人DNAMarkcr, I徐待泪tl样品外,还应同时1JII人参照品利f的书增产物。以30V Icm40 v Icm的电压电泳,使凝胶温度保待在约50C。电泳时间l.Sh2.Sh(电泳H才问
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