NY∕T 3629-2020 马铃薯黑胫病和软腐病菌PCR检测方法(农业).pdf
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1、ICS 65.020.01 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准NY /T 3629-2020 马铃薯黑腔病菌和软腐病菌PCR检测方法Detection of pathgenic bactera for potato blackleg and 80ft rot by PCR method 2020-07-27发布2020-11-01实施这2中华人民共和国农业农村部发布NY / T 3629-2020 杨l!1、T文革、部梅、T绍鹏、刘振字、芮云飞、张抒、万书明、刘尚武、张戚、邱彩玲、高他玲。T NY /T 3629- 2020 马铃薯黑腔病菌和软腐病菌PCR检测方法1 范围本标准规定了马
2、铃薯黑脏病商和l软腐病酶的PCR检测方法,其致病株主要包括黑JfJ!果胶杆Ji(Peclobacteriumtrose户licum,Pa)、协j)j!i卡软j向果胶杆菌扭J)llfI、亚非IP.c.rolovorum subsp.rolooorum ,Pcc)和1殉迎克氏菌Dickeya本标1ft适用于马铃薯试管在l2 规范性引用文件lnJua4Fhd户口7an吁an-AUYAeanan-AA哼GB/T 6682 3 原理拉i仅50X T八EI也泳缓冲液4.8 75%Z醇ii.tl仅无水乙鄙75mL,jm水定容至100mL, 4. 9 漠化Z绽溶液(10mg/mL)或GelRed核酸凝胶染料(
3、漠化乙绽替代物)称且呈淡化乙1JE200 mg,Jm水浴j酶,定容至20mL。GelRcd核股凝胶染料按照商品推荐稀释浓度使用.4. 10 1 0%琼脂糖凝胶板称i仅葫(jJ时f1. 0 g,jJU入lXTAE电泳缓冲液定容至100mL,微波炉中力n热至琼脂粉I融化,待溶液冷却至50C-60CI时,力n澳化乙饺溶液或GelRcd核自主凝胶染料5L,拯匀,倒入tM)皮板中均匀铺板,凝固后取下梳子,备HJ,4. 11 引物缓冲液月3水将上、下游引物分别配tIltl成工作浓度为10ng/J-lL的浴液。NY /1 3629- 2020 4. 12 2 000 bp DNA分子量标准物。4. 13 6
4、 X电泳l二样缓冲液。5 主要仪器5.1 PCR仪.5. 2 台式高速离心机(离心力1180g -12 470 g)。5. 3 咆泳仪、水平电泳Ali.5. 4 凝!庭成像仪。5. 5 移液然(0.1L-2.5L、O.5L-I0L、10L-100L、20L-200L、100L-I000L)。5. 6 灭菌锅等。6 操伟步骤6. 1 对照的设立试验分别设立阳性对!il、阴性对照和l空白对!l!( n用等体积的水代替换板DNA作空白对!自),在检测过程中耍同待测样品一同进行虫u下操作。6. 2 样品制备JlX马铃郭试笆曲、茎、块茎tjE管束组织或发病组织0.1g,现用现取或4.C条件下保存(少于7
5、d) 。6.3 DNA提取6.3. 1 植物组织样品DNA提取将样品j出于研非非中,!JII液氮研磨成粉末,转至1.5 mL离心管。后续跺作参见植物基因组DN八提l仅试11J众推荐步骤进行.6.3.2 菌株样晶DNA提取菌株水溶液经4000r/min离心后,弃掉上消液,留沉淀。后续操作参见植物基因组DNA提取试J盒推荐步骤进行。6. 4 PCR扩增6.4. 1 PCR扩增引物上、下游寻|物为Pa,P町、Dch的特异性引物,见附录A。6.4.2 PCR反应体系校表I顺1f-加l入相应试剂(缩赂语见附录),混匀,离心10s,使液体古nl沉降到HCR笆j鼠。表1PCR扩增反应体系试)11名称每个反应
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