WS∕T 588-2018 手足口病诊断(卫生).pdf
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1、ICS 11.020 C 59 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准 WS 5882018 手足口病诊断 Diagnosis for hand, foot and mouth disease 2018-03-06 发布 2018-08-01 实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 发 布 WS 5882018 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 术语和定义 . 1 3 缩略语 . 1 4 诊断依据 . 1 5 诊断原则 . 2 6 诊断 . 3 7 鉴别诊断 . 3 附录 A(规范性附录) 手足口病相关肠道病毒特异性抗体检测 . 5 附录 B(规范性附录
2、) 手足口病相关肠道病毒核酸检测 . 10 附录 C(规范性附录) 手足口病相关肠道病毒的分离和鉴定 . 14 WS 5882018 II 前 言 本标准第6章为强制性条款,其余为推荐性条款。 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准起草单位:首都医科大学附属北京地坛医院、中国疾病预防控制中心、首都医科大学附属北京儿童医院、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。 本标准主要起草人:李兴旺、杨维中、王子军、钱素云、陈志海、许文波、张静、卢联合。 WS 5882018 1 手足口病诊断 1 范围 本标准规定了手足口病的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。 本标准适用于全国各级各类
3、医疗卫生机构及其医务人员对手足口病的诊断。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 手足口病 hand,foot and mouth disease 由人肠道病毒71型(EV-A71)和柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)等肠道病毒引起的急性传染病,多见于学龄前儿童。重症病例多由EV-A71感染所致。 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE:细胞病变效应(cytopathic effect) CV-A16:柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16) cDNA:互补DNA dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleotide triphos
4、phate) EDTA:乙二胺四乙酸 ELISA:酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay) EV-A71:人肠道病毒71型(human enterovirus A71) HEPES:4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液 Hep-2:人喉癌上皮细胞 IgG:免疫球蛋白 G(immunoglobulin G) IgM:免疫球蛋白M(immunoglobulin M) MEM:Eagles 培养液(eagles minimum essential medium) OPD:邻苯二胺 RD:人横纹肌肉瘤细胞 RT-PCR:逆转录-聚合酶链反应(reverse tran
5、scription-polymerase chain reaction) TMB:3,3,5,5-四甲基联苯胺 Vero:非洲绿猴肾细胞 4 诊断依据 WS 5882018 2 4.1 流行病学特点 一年四季均可发病,具有季节性分布特点,南方可出现春夏季主高峰和秋冬季次高峰,北方主要出现夏秋流行,尤其是夏季。肠道病毒传染性强、隐性感染比例大、传播途径复杂、传播速度快,在短时间内可造成较大范围的流行,流行期间,可在幼儿园、托幼机构、家庭等地出现聚集性或暴发疫情。 4.2 临床表现 潜伏期一般为2 d10 d,平均3 d5 d。 急性起病, 发热, 手、 足和臀部出现斑丘疹、 疱疹, 口腔黏膜或咽
6、峡部出现散在疱疹。 可伴有咳嗽、流涕、食欲不振、腹泻等症状。 部分病例仅表现为手、足和臀部皮疹和/或咽峡部疱疹。少数病例皮疹不典型,表现为细小沙粒状皮疹、单部位皮疹或无皮疹。 少数病例可累及中枢神经系统,表现为脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎,甚至出现肺水肿、肺出血和/或循环功能障碍等,病情进展迅速,可致死亡。 4.3 实验室检查 4.3.1 一般检查 4.3.1.1 血常规 白细胞计数正常或降低,重型和危重型病例白细胞计数可升高。 4.3.1.2 血糖 危重型病例可升高。 4.3.1.3 脑脊液 中枢神经系统受累时常表现为:外观清亮,压力增高,白细胞计数增多,多以单核细胞为主,蛋白正常或轻度增多,糖和
7、氯化物正常。 4.3.2 血清学及病原学检查 4.3.2.1 用 ELISA 等方法在患者血清或脑脊液中检测到抗 EV-A71 或 CV-A16 等肠道病毒 IgM 抗体(见附录 A)。 4.3.2.2 用 ELISA 或中和试验等方法检测患者血清中 EV-A71 或 CV-A16 等肠道病毒 IgG 抗体,恢复期血清比急性期有4 倍升高或急性期抗体阴性而恢复期抗体阳转。 4.3.2.3 用 RT-PCR、荧光定量 RT-PCR 等方法从患者鼻咽拭子、肛拭子、粪便、疱疹液、脑脊液或尸检标本中检测到 EV-A71 或 CV-A16 等肠道病毒特异性核酸(见附录 B)。 4.3.2.4 用 RD、
8、HEp-2 或 Vero 等细胞系对患者鼻咽拭子、肛拭子、粪便、疱疹液、脑脊液或尸检标本进行病毒培养,可分离到 EV-A71 或 CV-A16 等肠道病毒(见附录 C)。 5 诊断原则 5.1 根据临床表现及一般实验室检查结果可做出临床诊断和分型。流行病学资料可作为参考。 WS 5882018 3 5.2 确诊需要手足口病相关病原学和血清学检测的阳性结果。 6 诊断 6.1 临床诊断病例 符合4.2,并排除其他相关疾病。 6.2 确诊病例 临床诊断病例,并具有4.3.2之一者。 6.3 临床分型 6.3.1 普通型 手、足、臀部皮疹,口腔黏膜疱疹,伴或不伴发热。 6.3.2 重型 出现中枢神经
9、系统受累表现,如:精神差、嗜睡、易惊、谵妄;头痛、呕吐;肢体抖动、肌阵挛、眼球震颤、共济失调、眼球运动障碍;无力或急性弛缓性麻痹;惊厥。可见脑膜刺激征,腱反射减弱或消失。实验室检查可有白细胞和血糖升高。 6.3.3 危重型 重型病例出现下列情况之一者: a) 频繁抽搐、昏迷、脑疝等严重中枢神经系统受损表现; b) 呼吸困难、血性泡沫痰、紫绀等呼吸功能障碍表现; c) 皮肤花斑、四肢冰凉、心率明显加快、血压明显上升或下降等循环功能障碍表现。 7 鉴别诊断 7.1 其他出疹性疾病 手足口病普通型应与丘疹性荨麻疹、 水痘、 不典型麻疹、 幼儿急疹、 带状疱疹以及风疹等疾病鉴别。可根据流行病学、皮疹形
10、态、部位、出疹时间及顺序、有无淋巴结肿大以及伴随症状等进行鉴别,以皮疹的形态及部位最为重要。最终可依据病原学和血清学检测结果进行鉴别。 7.2 其他病毒所致脑膜炎或脑炎 由其他病毒引起的脑膜炎或脑炎, 如单纯疱疹病毒、 巨细胞病毒、 EB病毒、 流行性乙型脑炎病毒等,临床表现与手足口病出现的中枢神经系统损害表现相近。对皮疹不典型者,根据流行病学史、病原学或血清学检查结果做出诊断。 7.3 脊髓灰质炎 手足口病出现急性弛缓性麻痹(AFP)时应与脊髓灰质炎鉴别。后者主要表现为双峰热,病程第2周退热前或退热过程中出现弛缓性麻痹,且无皮疹。最终依据病原学检测结果鉴别。 7.4 肺炎 WS 588201
11、8 4 手足口病危重型病例可发生肺水肿,应与肺炎鉴别。肺炎主要表现为发热、咳嗽、呼吸急促等呼吸道症状,一般无皮疹;病情进展相对缓慢,胸片加重或减轻均呈逐渐演变,可见肺实变病灶、肺不张及胸腔积液等。 WS 5882018 5 附 录 A (规范性附录) 手足口病相关肠道病毒特异性抗体检测 A.1 ELISA检测EV-A71 IgM抗体 A.1.1 试验材料 试验材料如下: a) 微孔板:包被抗人 IgM; b) 抗原试剂:含 EV-A71 抗原; c) 酶标试剂:辣根过氧化物酶标记的 EV-A71 抗体; d) 阳性对照:含抗 EV-A71 IgM 抗体阳性血清; e) 阴性对照:不含抗 EV-
12、A71 IgM 抗体血清; f) 标本稀释液:含蛋白缓冲液; g) 浓缩洗涤液:含不低于 2.5的表面活性剂; h) 底物:TMB 或 OPD; i) 终止液:含硫酸,浓度 2 mol/L。 A.1.2 标本 标本如下: a) 血清或血浆,含或不含 EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的标本。无悬浮纤维蛋白或聚合物、重度溶血、细菌污染。 b) 脑脊液。 A.1.3 步骤 因不同试剂盒操作方法及流程不同, 具体操作按照其试剂说明书进行, 本文以ELISA通用操作为例,检测步骤如下: a) 试剂室温平衡 30 min 以上; b) 配液:将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水 20 倍稀释; c) 编号:将标
13、本对应微孔板按序编号,每板应设阴性对照 3 孔,阳性对照 2 孔和空白对照 1 孔; d) 加稀释液:每孔加入标本稀释液 100 L,空白孔除外; e) 加样:分别在相应孔中加入待测标本或阴性、阳性对照 10 L,轻轻振荡混匀(脑脊液可以 12 稀释); f) 孵育:用封板膜封板后,37孵育 30 min; g) 洗板:小心揭掉封板膜,用洗板机洗涤 5 遍,最后一次扣干; h) 加抗原:每孔加入抗原试剂 50 L,空白孔除外; i) 加酶:每孔加入酶标试剂 50 L,空白孔除外,轻轻振荡混匀; j) 孵育:用封板膜封板后,37孵育 30 min; k) 洗板:小心揭掉封板膜,用洗板机洗涤 5
14、遍,最后一次扣干; l) 显色:每孔加入显色剂 A、B 液各 50 L,轻轻振荡混匀,37避光显色 15 min; WS 5882018 6 m) 测定: 每孔加入终止液 50 L, 轻轻振荡混匀, 10 min 内测定结果, 设定酶标仪波长于 450 nm,用空白孔调零后测定各孔 OD 值。 A.1.4 试剂对照范围 A.1.4.1 阴性对照OD值0.1。若1孔阴性对照OD值0.1应舍弃,若2孔或3孔阴性对照OD值0.1,应重复试验。 A.1.4.2 阳性对照OD值0.8。 A.1.5 结果判断 A.1.5.1 临界值(cutoff)计算:临界值=0.1+阴性对照OD均值。 (阴性对照孔OD
15、值低于0.05按0.05计算) 。 A.1.5.2 阴性判定:标本OD值临界值,为EV-A71 IgM抗体阴性。 A.1.5.3 阳性判定:标本OD值临界值,为EV-A71 IgM抗体阳性。 A.2 手足口病肠道病毒中和抗体检测 A.2.1 液体配制 A.2.1.1 血清处理液(A液) 100 mL中含下列液体: a) MEM,85 mL; b) 3 L-谷氨酰胺,1 mL; c) 7.5碳酸氢钠,2 mL; d) 胎牛血清,2 mL; e) 青、链霉素(各 10 000 U/mL),10 mL。 A.2.1.2 细胞营养液(B液) 按生长液配方配制,100 mL中含下列液体: a) MEM,
16、85 mL; b) 3 L-谷氨酰胺,1 mL; c) 7.5碳酸氢钠,2 mL; d) HEPES,1 mL; e) 胎牛血清,10 mL; f) 青霉素、链霉素(各 10 000 U/mL),1 mL。 A.2.1.3 病毒(血清)稀释液(C液) 按维持液配方配制,100 mL中含下列液体: a) MEM,93 mL; b) 3 L-谷氨酰胺,1 mL; c) 7.5碳酸氢钠,2 mL; d) HEPES,1 mL; WS 5882018 7 e) 胎牛血清,2 mL; f) 青霉素、链霉素(各 10 000 U/mL),1 mL。 A.2.2 攻击病毒CCID50滴定和滴度梯度制备(EV
17、-A71或CV-A16) A.2.2.1 将增殖后的病毒悬液冻融3次,然后在4、12 000 r/min条件下离心10 min,取上清液分装于 20支冻存管中,每管0.5 mL,保存在70冰箱长期保存。每次中和试验取一管,每管应在一次试验中用完,有剩余者应灭活后废弃。 A.2.2.2 加Eagle液10倍系列稀释为10-810-1病毒液,各加入细胞板内,每孔50L,每稀释度4孔细胞。 A.2.2.3 每孔加细胞悬液50L,同时设细胞对照(50L稀释液+50L细胞悬液) , 36培养7 d,观察细胞病变。 A.2.2.4 按Behrens-Krber公式计算出分离病毒株的CCID50。 A.2.
18、2.5 正式试验前应先滴定攻击病毒2次3次,取其平均值,求出每0.05 mL中含100 CCID50的病毒载量。 A.2.2.6 按照计算好的稀释比例配制攻击病毒,求出试验所需的病毒总量(即100 CCID50/0.05 mL) 。 A.2.2.7 取3支小试管,每支加病毒稀释液(液体配制中的C液)0.9 mL。 A.2.2.8 用带滤芯的吸尖(ART吸尖)吸0.1 mL已经稀释好的攻击病毒液(即100 CCID50/0.05 mL)到第一支小试管中,换另一支ART吸尖,轻轻并彻底地混匀,避免产生大量气溶胶,按照此方法依次稀释至0.1 CCID50/0.05 mL。 A.2.3 稀释血清 A.
19、2.3.1 发病1 d7 d内采集的患者急性期血清, 发病后3周4周采集的恢复期血清, 分别-20冻存备检。 A.2.3.2 取无菌小试管若干支(每份血清使用一支)置试管架上,每管加血清处理液(A.2.1.1液体配制中的A液)0.3 mL,加待测血清0.1 mL,盖紧塞子,振摇混匀,放4冰箱过夜,即为1:4稀释血清。次日56、30 min灭活。 A.2.3.3 打开独立无菌包装48孔组织培养板,纵向使用,每孔加血清稀释液(A.2.1.3液体配制中的C液)0.3 mL, 每份血清使用一排, 每排4孔。 使用移液器取处理过的血清0.1 mL加入第一孔 (即为1:16) ,吹吸8次10次,吸0.1
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