SN∕T 5199-2020 家畜家禽成分DNA条形码检测技术规范(出入境检验检疫).pdf
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1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51992020代替 SN/T 11622002家畜家禽成分 DNA 条形码检测技术规范Inspection protocol for livestock-derived and poultry-derived ingredients with DNA barcode method中华人民共和国海关总署发 布ICS 07.080CCS B 432020-12-30 发布2021-07-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准ISN/T 51992020前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件由中华人民共
2、和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国拱北海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国重庆海关、中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国厦门海关。本文件主要起草人:罗宝正、薄清如、邵建宏、王勤、赵福振、吴绍强、廖秀云、吕继洲、徐海聂、聂福平、陈轩、沙才华、郑传发、杨俊 、苗丽、唐泰山、孔繁德。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 51992020家畜家禽成分DNA 条形码检测技术规范1范围本文件规定了家畜、家禽成分 DNA 条形码检测方法。本文件适用于家畜、家禽单一物种样品的检测,不适用于多物种混合样品中动物成分的检测。2规范性引用文件下列文件中
3、的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 家畜livestock人工饲养驯化且可以人为控制其繁殖的哺乳纲动物,如猪、牛、绵羊、山羊、马、驴、骡、骆驼、兔、猫、狗等。3.1.2 家禽poultry人工饲养的为了获取其肉、卵和羽毛等的鸟纲动物,一般
4、为雉科和鸭科动物,如鸡、鸭、鹅等,也有其他科的鸟类如火鸡、鸽子、鹌鹑等。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。CTAB :十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl ammonium bromide) 。Cytb :细胞色素 b (cytochrome b) 。DNA :脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid) 。EDTA :乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid) 。Na2EDTA :乙二胺四乙酸二钠(ethylene diaminetetraacetic acid disodium salt) 。Tris :三羟甲基氨基甲烷(t
5、ris (hydroxymethyl) aminomethane) 。PCR :聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) 。TBE :缓冲液(tris-borate-EDTA buffer) 。以正式出版文本为准2SN/T 519920204原理DNA 条形码(DNA barcode)是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的 DNA 片段。在遇到一种未知物种或者物种的一部分时,通过描绘其组织的 DNA 条形码,与国际数据库内的其他条形码进行比对,如果与其中一个相匹配,便可确认物种。本标准使用的PCR 引物可以同时扩增家畜、家禽甚至更多脊
6、椎动物的一段线粒体(mitochondrion)DNA,通过序列分析和比对,进行物种鉴定。5试剂和材料5.1DNA 提取试剂5.1.1裂解液,配制方法见附录 A。5.1.2苯酚。5.1.3三氯甲烷与异戊醇混合液(按 24 : 1 的比例混合) 。5.1.43 mol/L 乙酸钠。5.1.5无水乙醇。5.1.670% 乙醇。5.1.7TE 缓冲液(Tris-EDTA buffer) ,配制方法见附录 A。5.2PCR 扩增试剂5.2.1Master Mix(2) 。5.2.210 mol/L 上游引物(序列 5 -CCC-CGC-CTG-TTT-ACC-AAA-AAC-AT-3) 。5.2.31
7、0 mol/L 下游引物(序列 5-GCT-CCA-TAG-GGT-CTT-CTC-GTC-TT-3) 。5.2.4双蒸水,应符合 GB/T 6682 的要求。5.2.5去离子水,应符合 GB/T 6682 的要求。5.3凝胶电泳试剂5.3.12% 琼脂糖凝胶。5.3.2TBE 溶液(1) ,配制方法见附录 A。5.3.3溴化乙锭或焦红。6仪器设备6.1电子天平。6.2微量移液器。6.3恒温水浴锅。6.4台式冷冻离心机。6.5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.6PCR 检测系统。6.7电泳仪。6.8凝胶成像分析系统。以正式出版文本为准3SN/T 519920207检验步骤7.1概论7.1.1
8、样品总 DNA 提取、DNA 浓度和纯度测定、PCR 扩增、凝胶电泳分析过程按照 GB/T 27401 和 GB/T 27403 的要求进行。7.1.2对于干制样品,应首先进行水洗清理表面或刮掉表面可能污染的动物或人源 DNA。对于新鲜样品,应从样品内部取样。7.1.3设立质控阴性对照和阳性样品对照,阴性对照、阳性对照和检测样品使用相同方法提取 DNA。阳性对照使用任意一种家畜、家禽肉样(如牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅等) ,阴性对照使用任意一种非脊椎动物肉样(如虾、螃蟹、海星等) ,阴性样品应无其他动物和人源 DNA 污染。7.1.4可以使用等效的 DNA 提取试剂进行 DNA 提取。7.2样品总
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