DB 61∕T 1138-2018 水质 粪大肠菌群的测定 酶底物法.pdf
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1、ICS 13.060.70Z 16DB61陕西省地方标准DB 61/T 11382018水质 粪大肠菌群的测定 酶底物法Water qualityDetermination of fecal coliformsEnzyme substrate method2018 - 04 - 12 发布2018 - 05 - 12 实施陕西省质量技术监督局发 布DB61/T 11382018I目次前 言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14方法原理.15试剂与材料.16仪器与设备.27样品.28分析步骤.39结果计算与表示.410质量保证和质量控制.511废物处理.5附录 A(资料性附录)酶
2、底物法培养基的基本成分. 6附录 B(规范性附录)粪大肠菌群检数表.7附录 C(规范性附录)51 孔定量孔板 MPN 表.8附录 D(规范性附录)97 孔定量孔板 MPN 表.1DB61/T 11382018II前 言本标准按照GB/T 1.12009和HJ 1682010给出的规则起草。本标准由陕西省环境监测中心站和陕西省环境保护厅提出。本标准由陕西省环境保护厅归口。本标准起草单位:陕西省环境监测中心站。本标准主要起草人:许锋、张会强、刘敏、周弛、吴卫东、马文鹏、张秦铭、宁西翠、许伊蕾、张静雪。本标准由陕西省环境监测中心站负责解释。本标准首次发布。联系信息如下:单位:陕西省环境监测中心站电话
3、:029-85429127地址:陕西省西安市雁塔区西影路106号邮编:710054DB61/T 113820181水质 粪大肠菌群的测定 酶底物法1范围本标准规定了水中粪大肠菌群测定的酶底物法的术语和定义、方法原理、试剂与材料、仪器与设备、样品、分析步骤、结果计算与表示、质量保证和质量控制、废物处理的要求。本标准适用于地表水、生活污水和废水中粪大肠菌群的测定。当接种量为300mL时,方法的检出限为3MPN/L,检测范围为3MPN/L230MPN/L;当接种量为100mL时,方法的检出限为10MPN/L,采用51孔定量孔板的检测范围为10MPN/L2005MPN/L,采用97孔定量孔板的检测范围
4、为10MPN/L24196MPN/L。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 5750.12 生活饮用水标准检验方法 微生物指标GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1粪大肠菌群 fecal coliforms粪大肠菌群,又称耐热大肠菌群(thermotolerant coliforms)。是一种通常在44.5下培养发酵乳糖产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。3.2最可能数 most p
5、robable number;MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。4方法原理粪大肠菌群在邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)培养基上培养产生-D-半乳糖苷酶(-D-galactosidase),该酶可以分解色源底物释放出黄色的邻硝基苯酚,通过颜色变化定性,MPN法定量。5试剂与材料DB61/T 1138201825.1除非另有说明,所用试剂均为分析纯,水为符合 GB/T 6682 中规定的一级水。5.2培养基选择市售商品化酶底物法试剂,或自行配制培养基,基本成分参照附录 A。5.3硫代硫酸钠(Na2S2O3)。5.4乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)。5.5氯化钠(NaCl)。5.6硫代
6、硫酸钠溶液:(Na2S2O3)0.10g/mL。注:称取硫代硫酸钠(5.2)10g,适量水溶解,定容至100mL,临用现配。5.7乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液:(C10H14N2O8Na22H2O)0.15g/mL。注:称取乙二胺四乙酸二钠(5.3)15g,适量水溶解,定容至100mL,摇匀,常温下可存放30d。5.8灭菌生理盐水:(NaCl)=0.9%(m/v)。注:称取氯化钠(5.4)0.9g,适量水溶解,定容至100mL,经121高压蒸汽灭菌20min,备用。6仪器与设备6.1采样瓶:500mL 棕色磨口玻璃瓶。6.2恒温培养箱:44.50.5。6.3高压蒸汽灭菌器:121、
7、0.101Mpa。6.4冰箱:04。6.5恒温干燥箱:0300。6.6程控定量封口机:带 51 孔和 97 孔胶托。6.751 孔和 97 孔定量孔板:无菌。6.8100mL 无菌取样瓶。6.9试管:15mm150mm,带透气胶塞。6.10标准阳性比色盘。6.11移液管:1mL、10mL,也可采用体积可调式移液器。6.12锥形瓶:500mL。6.13量筒:100mL。6.14移液管、试管、量筒、采样瓶等均需包扎后经 121高压蒸汽灭菌 20min,备用。7样品7.1样品采集7.1.1与其他项目一同采样时,先单独采集微生物样品。采样瓶(6.1)不得用水样洗涤,按照无菌操作的要求采集水样于灭菌的采
8、样瓶中。7.1.2采集江、 河、 湖、 库等地表水时, 可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中, 距水面约 10cm15cm 处,瓶口朝水流方向,拔玻璃瓶塞,使水样灌入瓶内然后盖上瓶塞,将采样瓶从水中取出。如果没有水流,可握住瓶子水平前推。采样后瓶内要留足够的空间,一般采样量为采样瓶容量的 80%左右。采好水样后,迅速盖好瓶盖并扎上无菌包装纸。7.1.3从龙头装置采集样品时, 要选用完好无损的龙头, 采水前将龙头打开至最大, 放水 3min5min;然后将龙头关闭,用火焰灼烧约 3min 灭菌,开足龙头,再放水 1min。采样时控制水流速度。7.1.4采集地表水、废水样品及一定深度的水样时,可
9、使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时,应自上而下进行。DB61/T 1138201837.2样品保存样品在10以下冷藏运输,运输时间不超过6h。实验室接样后不能立即展开检测的,应将样品放入04冰箱(6.4)保存,在2h内检测。7.3干扰和消除酸性样品, 应在分析前按无菌操作要求调节样品pH值至7.08.0。 在采样瓶灭菌前加入0.4mL硫代硫酸钠溶液(5.5)以除去余氯对细菌的抑制作用;在采样瓶灭菌前加入1.2mL乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶液(5.6)以除去重金属对细菌的抑制作用。8分析步骤8.1水样接种量水样充分混匀后,根据水样污染的程度确定水样的接种量,水样
10、的接种量可参考表1。表 1水样接种量参考表水样类型接种量(mL)30010010110-110-210-310-410-510-6地表水(湖、库)地表水(江、河)生活污水废水(工业废水)废水医疗机构排放污水(处理前)废水医疗机构排放污水(处理后)废水(畜禽养殖业等排放废水)注:接种量为10-110-6mL时,需要稀释或逐级稀释,稀释方法见8.2.2。8.2接种8.2.1清洁水样8.2.1.1接种量为 300mL 时,接种水样为 2 份 100mL 和 10 份 10mL。8.2.1.2量取 2 份 100mL 水样,分别加入 2 个 100mL 无菌取样瓶(6.8)中,各加入 2.7g0.5g
11、 酶底物法试剂(5.1),充分混匀溶解;量取 100mL 灭菌生理盐水(5.7),加入 2 份 2.7g0.5g 酶底物法试剂(5.1),充分混匀溶解,分装于 10 个无菌试管(6.9)中,每管含 10mL 溶液。量取 10 份 10mL水样接种于上述 10 个含 10mL 溶液的试管中,加塞密封。8.2.2受污染水样8.2.2.1接种量为 100mL 时,用无菌取样瓶(6.8)量取 100mL 水样,加入 2.7g0.5g 酶底物法试剂(5.1),充分混匀溶解,将溶解液倒入 51 孔或 97 孔定量孔板(6.7)中(根据水样污染程度选择合适的孔板),排除气泡后用程控定量封口机(6.6)进行封
12、口。8.2.2.2接种量100mL 时, 以 10-4为例, 取 1mL 水样加入 100mL 无菌取样瓶中, 用灭菌生理盐水 (5.7)稀释定容至刻度线,混匀,再取稀释后的水样 1mL,重复上述操作,以下操作按照 8.2.2.1 进行。DB61/T 1138201848.3培养将8.2.1和8.2.2中接种后的取样瓶、试管或孔板放入恒温培养箱中44.50.5培养24h2h。8.4对照试验8.4.1空白试验用灭菌生理盐水(5.7)代替样品按照8.2和8.3进行测定。8.4.2阳性及阴性对照8.4.2.1粪大肠菌群测定的阳性菌株为大肠埃希氏菌(Escherichia.coli),阴性菌株为产气肠
13、杆菌(Enterobacter aerogenes)。8.4.2.2标准菌株的菌悬液浓度建议使用 0.3 麦氏浓度值0.4 麦氏浓度值,取适量后按照 8.2.2.2进行接种,按 8.3 培养后,大肠埃希氏菌呈现阳性反应,产气肠杆菌呈现阴性反应。8.5结果判读取样瓶、试管或孔板经培养后,对照阳性比色盘(6.10),水样变黄判断为粪大肠菌群阳性,不变色判断为粪大肠菌群阴性。记录取样瓶、试管阳性个数,51孔定量孔板(6.7)记录大孔阳性数,97孔定量孔板(6.7)分别记录大孔和小孔阳性数。9结果计算与表示9.1结果计算9.1.1接种量为 300mL根据8.5中取样瓶和试管阳性个数,查MPN表(附录B
14、)可得每升水样中粪大肠菌群MPN数。9.1.2接种量100mL根据8.5中51孔定量孔板阳性数,查51孔MPN表(附录C);根据8.5中97孔定量孔板大孔和小孔的阳性数,查97孔MPN表(附录D)。再根据样品的稀释度,按公式(1)换算为每1L水样中粪大肠菌群的浓度。fMPNC10=值.(1)式中:C每升水样中粪大肠菌群数,MPN/L;值MPN查51孔或97孔MPN表所得数,MPN/100 mL;f接种样品的稀释度。9.2结果表示测定结果应保留二位有效数字,大于等于100时以科学计数法表示,单位为MPN/L。DB61/T 11382018510质量保证和质量控制10.1实验室应设置阳性对照、阴性
15、对照和空白对照。10.2每批培养基应按本标准 8.4 的要求采用有证标准菌株进行阳性、阴性对照试验(见表 2)。10.3宜选用市售商品化培养基,以减少配制中产生的误差。10.4应定期使用有证标准物质/样品进行质量控制。10.5每批样品至少测定 10%的平行双样,检测结果以算数平均值计。表 2阳性、阴性对照菌株参考表菌株名称英文名菌株编号大肠埃希氏菌Escherichia coliCICC 24176产气肠杆菌Enterobacter aerogenesCICC 10293 或 ATCC 1304811废物处理使用后的器皿及废弃物应经121高压蒸汽灭菌30min处理。DB61/T 1138201
16、86AA附录A(资料性附录)酶底物法培养基的基本成分A.1酶底物法培养基的基本成分酶底物法培养基参照GB/T 5750.12中规定的基本成分进行配制,见表A.1。表 A.1酶底物法培养基的基本成分成分分子式或缩写含量硫酸铵(NH4)2SO45.0g硫酸锰MnSO40.5mg硫酸锌ZnSO40.5mg硫酸镁MgSO4100mg氯化钠NaCl10g氯化钙CaCl250mg亚硫酸钠Na2SO340mg两性霉素 BAmphotericin B1mg邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷ONPG500mg4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷MUG75mg茄属植物提取物Solanium 萃取物500mgN-2-羟乙基哌嗪
17、-N-2-乙磺酸钠盐HEPES 钠盐5.3gN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸HEPES6.9g水H2O1000mLDB61/T 113820187BB附录B(规范性附录)粪大肠菌群检数表B.1粪大肠菌群检数表粪大肠菌群检数表见表B.1。表 B.1粪大肠菌群检数表10mL水样的阳性管数100mL水样的阳性瓶数0121L水样中粪大肠菌群数1L水样中粪大肠菌群数1L水样中粪大肠菌群数03411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230DB61/T 113820188CC附录C(规范性附录)51 孔
18、定量孔板 MPN 表C.151 孔定量孔板MPN表51孔定量孔板MPN表见表C.1。表 C.151 孔定量孔板 MPN 表阳性孔数MPN 值95%可信范围下限95%可信范围上限010.03.711.00.35.622.00.67.333.11.19.044.21.710.755.32.312.366.43.013.977.53.715.588.74.517.199.95.318.81011.16.120.51112.47.022.11213.77.923.91315.08.825.71416.49.827.51517.810.829.41619.211.931.31720.713.033.31
19、822.214.135.21923.815.337.32025.416.539.42127.117.741.62228.819.043.92330.620.446.32432.421.848.72534.423.351.22636.424.753.92738.426.456.62840.628.059.5DB61/T 113820189表 C.1(续)2942.929.762.53045.331.565.63147.833.469.03250.435.472.53353.137.576.23456.039.780.13559.142.084.43662.444.688.83765.947.29
20、3.73869.750.099.03973.853.1104.84078.256.4111.24183.159.9118.34288.563.9126.24394.568.2135.444101.373.1146.045109.178.6158.746118.485.0174.547129.892.7195.048144.5102.3224.149165.2115.2272.250200.5135.8387.651200.5146.1DB61/T 113820181DD附录D(规范性附录)97 孔定量孔板 MPN 表D.197 孔定量孔板MPN表97孔定量孔板MPN表见表D.1、表D2和表D3
21、。表 D.197 孔定量孔板 MPN 表(小孔阳性孔数 016)大孔阳性孔数小孔阳性孔数012345678910111213141516011.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.013.014.115.116.111.02.03.04.05.06.07.18.19.110.111.112.113.214.215.216.217.322.03.04.15.16.17.18.19.210.211.212.213.314.315.416.417.418.533.14.15.16.17.28.29.210.311.312.413.414.515.516.517.6
22、18.619.744.15.26.27.28.39.310.411.412.513.514.615.616.717.818.819.921.055.26.37.38.49.410.511.512.613.714.715.816.917.919.020.121.222.266.37.48.49.510.611.612.713.814.916.017.018.119.220.321.422.523.677.58.59.610.711.812.813.915.016.117.218.319.420.521.622.723.824.988.69.710.811.913.014.115.216.317.
23、418.519.620.721.822.924.125.226.399.810.912.013.114.215.316.417.618.719.820.922.023.224.325.426.627.71011.012.113.214.415.516.617.718.920.021.122.323.424.625.726.928.029.21112.213.414.515.616.817.919.120.221.422.523.724.826.027.228.329.530.71213.514.615.816.918.119.320.421.622.823.925.126.327.528.62
24、9.831.032.2DB61/T 113820182表 D.1(续)1314.816.017.118.319.520.621.823.024.225.426.627.829.030.231.432.633.81416.117.318.519.720.922.123.324.525.726.928.129.330.531.733.034.235.41517.518.719.921.122.323.524.725.927.228.429.630.932.133.334.635.837.11618.920.121.322.623.825.026.227.528.730.031.232.533.73
25、5.036.337.538.81720.321.622.824.125.326.627.829.130.331.632.934.135.436.738.039.340.61821.823.124.325.626.928.129.430.732.033.334.635.937.238.539.841.142.41923.324.625.927.228.529.831.132.433.735.036.337.639.040.341.643.044.32024.926.227.528.830.131.532.834.135.436.838.139.540.842.243.644.946.32126.
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