WS 284-2008 人感染高致病性禽流感诊断标准(卫生).pdf
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1、ICS 11.020 c59 23225-2008 ws 中华人民共和国卫生行业标准ws 284-2008 人感染高致病性禽流感诊断标准Diagnostic criteria for human infecton with avian influenza virus 2008-02-28发布2008-09-01实施叶-rj=f、手1丑二日结三&rs发布ws 284-2008 目次前霄.r.E1 范围-2 术语和定义、缩略语3 诊断佳据.4.E.2 4 诊断原则.J.35 诊断标准6 鉴别诊断.3 附录A(规范性附录人禽流感病毒分离用养和鉴定方法. 4 附录B(规市性附录红细胞提靠抑制试验. 1
2、4 附录规范性附录)融量中和试验.民.,.15 附录D(资料性附录人禽流感病毒核酸院出1方法. . . . 21 附录E(规范性附录)免疫荧光法检测人禽流感病毒抗原.26附录F(资料性附录人禽流感的病原学、流行病学与临床表现特点.27ws 284-2008 目。昌根据中华人挝;共和国性提病防治法制定本标准。本标准的附录A、附录日、附录C、附录E是划范性附录,附录D、附录F是i配料性附录a本标准由卫生部传染病惊准专业委员会提出口本际准由中华人民共和国卫生部批准。本标准起草单位:中国疾病预防控制中,心、北京大学人民医院。本标准主要屈草人:郭元1f、余宏杰、高占戚、舒跃龙、冯子健、杨维中。H ws
3、284-2008 人感染高致病性禽流感诊断标准范围本如f佳规定了人感染高致病性禽流感的诠断依据、诊断原则、诊断和鉴别诠断。本括准适用于全国各级医疗卫生机构及其工作人员对人感染高致病性禽流感的诊断、报告。2 术语和定义插略语2. 1 术语和;主义下列术语和定义适用于本标准。2. 1. 1 人禽流感buman-avian influenza 由禽流J茜病毒中某些亚型病毒(目前报道的有H5,H7,H9及H10亚型病毒中的一些毒棒)所引起的急性呼吸道传染病,它所表现出的临床症状随所感染病毒的亚型不同而异:从结膜炎、轻做的上呼吸道卡他症收至出现急性呼咂窘迫综合征和多器官功能衰竭,甚至导致死亡。2. 1.
4、2 高致病性禽流盛highly patbogenic avian influenza, HPAI 甲型流感病毒基因组具有宿主特异性,井不是所有禽榄感病毒都能引起禽流感。根据对禽致病性的强弱,由流感病毒可升为高致病性、低致病性和1非致病性。但是这种致病性的划分仅对禽类而古l 0 按照国际兽医局(Officelnternational des Epizoot时,OIE)的判断标准:静脉内致病指数(intrave nous pathogenicity index, IVPI) 2. 3.3. O(披动在1.74-.3. 0)为高致病性;1.2-1.4为低致病性;OC眈动在0,.1.0)为非致病性。同
5、时还可用一种快捷的方法来测定:接种禽流感病毒于无特殊病原(special pathogen free, SPF)玛胚,收获其新鲜尿囊眩,HA滴度1 : 16,并细菌培养为阴性;至少静脚注射8只48周龄的SPF鸡.0.lmL/只;对照组两只鸡同部位注射O. 1皿L灭菌过的生理盐水。如果注射后8d内,实验组75%或以上玛死亡而对照组元死亡,为高致病性的;如只有少数鸡死亡为低致病性的;无死亡为非致病性的。除此而外,还有两个参考指标;一个为禽流感病毒颗桂血凝素蛋白重链(HAl)与轻链(HA2)之间连接AA耐性氨基酸的多寡,多的为高致病性.寡的为低或非致病性;另一个是在缺乏胆蛋白酶条件下?在细胞培养中能
6、形成惶斑的为高致病性,不能形成国斑的为低或非致病性。2. 1.3 流居样病glJ发热(体温二三380C),伴q主嗽豆)(;11国痛之一者,而缺王其他的实验室确定诊断依据。2.2 缩暗语以下缩略i吾适用于本标准。WHO: World Health Organization,世界卫生组织HPAl; highly pat hogellic avian influenza,高致病性禽流感。IE:Offce International desEpizooties,国际兽医局IVPI: intravenous pathogenicity index,静脏内致病指数SPF:special pathogen
7、free,无特殊病原ARDS:acute respiratory distress syndrome,急性呼吸窘迫结合征RT-PCR: reverse transcripton polymerase chain reaction,逆转录聚合酶链式反应HI: hemagglutination inhibition test,红细胞艇集抑制试验MN: microneutralization test,做量中和试验ws 284-2008 SARS: severe acute respiratory syndrome,严重急性呼吸综合征,传染性非典型肺炎IFA: immunofluorescence
8、assay,免度荧光试验3 t合断依据3. 1 流行病学史3. 1. 1 发病前7d内,接触过禽,尤其是病禽、死禽(包括野牛禽、家禽h或其排泄物、分四、物及7d内下的置.暴露F其捐|斗t!t物、分也物市捷的环境D3. 1.2 发病前14d内,曾经到过有活禽交易、宰杀的市场。3. 1.3 发病前14d内.与人庸流J毒草tbl、|而应诠l断实撞一主确诊病17IJ有过密切接触嘈包括与其共同生活、居住?豆豆护理过病例等。3. 1. 4 发病前 Hd内,在出现异常捕、曲地E岳自二、生品、工作3. 1.5 r旬危职业史:从事饲养、阻jt屠宰.JlfljI,诠治家禽T作的职业人员;可能暴露于动物和人禽配感病
9、毒攻潜在感染性材料的要监室职业人虽:怯采取严惰的个人l班伊措施,处置功物商致病性禽流感疫情的人员;未采取严格自树、人防护措施.i幸福、护平坦人流感哇、|陆出睡 断豆tgz验室确诠病例的医护人员。3.2 1面床表现(参见附录P)3.2.1 H7亚型人禽施感主要表现出培臣费、精上呼股道卡他!f状,3.2.2 H9N2 型人禽班感类似普通人流感飞iilJ.常仅有轻诞生崎同呼吸道感染症状。3.2.3 HI0N7呼平/)1-流感仅有轻散的J.I:.I呼吸道感染症状。吸窘迫综合植(指ut(.respiratory distress :Y.nmmt.:.叫四日、肺出血、响应积捕、全血细胞躏少、多旺黯功抱在喝
10、、休克及瑞(RlYo.:)综合寺多仲费:发症。可提发细菌感染,发生败血症。c)外用血象检查臼都跑品SK一般正常此降幅幅茧症患者多有白细胞总要淋巴细胞减少,井有血小板降低。d)体征:重症患者I可有i内部7巳e)胸部影像学:病初病变7形B在可气唠4茸即f阴丁页斗阴影i油戈i挠荧咱旦呈:絮状、瞄破哺样密庭崽恒J咱主症崽者病变进扣蜒5迅速咱ld2d内范固扩大.密l度主加深呈肺实主宜:密度边缘模糊,病变内可且空亏党吗管市气j店变多表现为两肺前:i曼性分布.没有明显的以段虱叶划分的特征,相当部分病例演变为白肺刀样改变,可合并胸腔积闹。3.3 实验室检刮3.3. 1 病毒分离病毒分离阳性主i二经亚型鉴定确认
11、(见附录A)0 3.3.2 血清学栓查3.3.2. 1 患者恢复期血清进行红细胞在集拥制(hemagglutination inhi bition, HD试验(见附录目。3.3.2.2 1址:查中和试验(microneutralizationtest.MNT),禽流!在病毒(HA)(H5或日7茸H9等亚型)抗体阳性(Hl抗体或中和抗体效价二三80)(见附录C,不含二三55岁者。2 3.3.2.3 恢复期血清抗体滴度比急性期血清高4倍或以上(见附录B和附录。03. 3. 3 睛毒抗原E核酸检测ws 284-2008 在患者的临床标本检查到人禽流感病毒特异性的核酸(参见附录。或特异的日亚型抗原(见
12、附录E)o4 诊断原则人禽流感病例的诊断需要结合病例的流行病学史、rI面床表现和实验室检测,综合进行判断。流行病学史是诊断的重要条件,但不是必要条件。确诊病例需要严格的病毒学或血清学检测证据,尤其是恢复期血清抗体滴度比急性期血清高4倍或以上的证据。为早期、及时发现人禽流感病例,医务人员应详细询问患者的流行病学史,根据流行病学史和|临床表现哥tf-tu人禽流感疑似病例诊断。5 诊断标准5. 1 人禽流感肆似病例具备3.1中任何一项,且无其耐明5.2 人禽流感临床珍断稿fll具备以下任何一项者:5.2. 1 具备3.1中任向.J.再加3.2中任前-顶,日-何;合3.3,2.1.3.3.2.2中任二
13、项。5.2.2 诊断为人禽流感时病例,无附4琐得其临严标本进行实验室确诊,而与其有共同暴露史的其他人己被诊断为禽流感确诊病例,并且没有其他在病确定诊断陆据者o5,3 人禽流感确桂病1fIJ具备以下任何-项者:5.3. 1 具各3,2.*轩一明加3.3.L 5,3.2 具备3,4中任一项加3.3.205.3.3 具备3,20中扭一项加3.3.3中任一项,并经曲尘i同实盔室所证实。5. 4 人禽流盛排除病制具备以下任何项的人禽流感疑似贯11自f在垄断病例:5.4. 1 患者禽流!脚时离阴性(3.3,1或病毒制及核酸检测阴性(3.3.刀,且恢复期血清比急性期血清的抗体滴度没有4耐捕以上增高;5.4.
14、2 死亡患者未毒集主llBJ性期和恢复期双份阜睛. P艳阳组朵病毒分离阴性(3.3.1)或病毒抗原及核酸检测阴性(3.3.3)t耳最和个不同实验宴所证实:5. 4. 3 有明确的其他现l制电悻陈据。6 鉴别诊断临床上应注意与人流感、上l嗨道l椒、组薛制附J传染性非典型肺炎(severeacute respiratory syndrome, SARS)、传染性单核细胞增茹症、巨细胞病毒感染、:坦病毒肺结合征、衣原体肺炎、支原体肺炎和艾滋病合井的各种肺部感染等疾病进行鉴剖楼昕7鉴别诊断主要依靠病原学、特异核酸检查和血清抗体测定。3 ws 284-2008 附录A(规范性附录)人禽流感病毒分离培养和
15、鉴定方法A.l 人禽流感情毒的分离培养A. 1. 1 lVIDCK细胞分离病毒方法A. 1. 1. 1 MDCK细胞培养技术A.1.1.1.1 生物安全组别和生物安全规定MDCK细胞培养实验室生物安全级别:生物安全三级实验室,应该遵守生物安全实验室相应的生物安全规定。A. 1. 1. 1.2 细胞培养的所需材料a)生长成片的MIXK细胞;b) T-75细胞培养瓶;c) D-tv1EM培养液;d)青:fii;素、链霉素母擅(10000U/mL青霉素;10 OOOf1.g/mL航酸链莓素),分装后保存于一20.C;e) HEPES瞿冲诵,lmol/L母谊;)胎牛血清;g) EDTA-膜南(0.05
16、%膜酶;0.53mmol/L EDTA 4Na),分装后保存于-20.C;h)牛血清白蛋白组分V,7.5%溶液;L) 1mL,10mL元菌移液管:j) 70%75%的酒精。建说:要求经营检查试if!J使用的有政期。A. 1. 1. 1. 3 培养基和试刑的准备a)古L-谷氨酸的完全型D-MEM培养植的准备(用于Iv1DCK培养):iOOmL D-tv1EM被中加入:1)青毒素、链霉素母蔽5mLC主要榷度达:100U/mL青霉素;100g/mL链霉素); 2) HEPES缓冲撞12.5mLC终站度:25mrnoljU ; 3) 7.5%牛血清白蛋白组分V12. 5mL. b)细胞生长液胎牛血清1
17、0mL加到90mL的完全型D-MEM植使胎牛血清的终陆度为10%。A. 1. 1. 1.4 M配K细胞的培养程序这里以T-75细胞瓶单层培养为例,叙述MDCK细胞的培养程序Q如果细胞瓶的规格有变,MDCK细胞悬植的量榷度必须做相应的调整。用于细胞培养的培养基、EDTA-膜酶等,应先煎置37C水浴预热。4 的首先将细胞培养瓶中的培养液弃去,加入5mL在37C水陆中预热的EDTA胆醋。b)温和地摇动细胞瓶1min,使EDTA-膜酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移被管吸去EDTA腰酶。c)重新加入5mL在37C水陆中预热的EDTA-膜酶重复上述步骤。d)加入lmLEDTA-膜酶使其均匀分布在整个细胞
18、薄层,37C孵育细胞瓶直至细胞从塑料表面分高(5min10min) 0自、要时可以摇动吹打来分离细胞。加入1mL胎牛血?古来中和费余的膜酶活性ews 284-2008 e)加9mL完全型D-MEM,轻轻用移动蒂;在管来吹散细胞团由f)取10mL旭合物加到90mL细胞生|是植,该i古养植含主要谁度为10%的胎牛血清。(细胞悬班的地度大约为每mL含10个细胞hg)每个T-25细胞培养瓶加6mLC6DO 000个细胞)悬摘,剩余的细胞,每擅可以加到T-75细胞m用于细胞传代。通常6mL细胞悬被数日可长戚戚片生长的细胞。h)于3TC培养箱里培养细胞.每天观察细胞状态DA. 1. 1. 1. 5 细胞的
19、冻存a)细胞1f,材料1)成片的MDCK细胞t细胞生长良好存活率高,成片丰达80%90%;2)二甲菲亚枫(DMSO); 3)胎牛血清;的EDT胆爵的.05%眼高;O. 53mmol/L EDTA 4Na) ; 5)移植管:1mL, 10rnLo b)细胞叶;存步骤1)冻存植的配置:9mL台牛血清,lmL二甲基、lP.帆;2)细胞泊比:消化过程同细胞培养的消化;3)细胞消化后,加入配置好的细胞阵、存被J昆匀后分装到细胞冻存管内;4)细胞冻存浓度为1汩lO/mL;5)细胞冻存过程:40C罚,一zo.C拙,放人幢氮长期保存。A. 1. 1. 1. 6 细胞的复苏;%存细胞复苏原则为快速解西L以矗免,
20、(lJc晶重甜结晶对细胞造成伤害,而导致细胞凋亡。细胞,号比后?需要数日或撞撞传代一至二代.其细胞1:长!11II1l包特性表现才会恢复正常3a)材料l) 37C恒yffil水陆箱。2)细胞吱长擅完全型D-MEM9rr让胎牛血清1mL 3) T-25培养瓶,无菌移被管。4) 70%75%的酒精。的移植管:1mL, 10mL. b)细胞复苏步骤)将细胞生长榷放人3TC水泊顶热,fiJi热后以70%75%的酒精擦拭,放人生物安全柜内。2)自液缸中取出细胞陈存营,检查盖子)t否旋紧,由于热胀玲缩过程盖子容易松掉。3)立即放人37C水陆中快速解眩,轻轻摆动使其在1min内全部融化,以70%75%的酒精
21、擦技保存管外部,移人生物安全柜内。的取出1.0mL解J东的细胞陈存;:i蟹慢加入事先加好5mL生长?在的T-Z5细胞培养瓶内,?昆合均匀,放入培养柏培养。5) ()z日,观事细胞形态,并且更换细胞生长准。A. 1. 1. 1. 7 质量控制MDCK细胞代数的增加会降低其对呼吸道病毒的敏感性。因此实验室应保持低代次的细胞株在被氨中。为了保持该分离系统的敏感性,可细胞草苏后被压续传15代20代,达到,10代以上时,在间隔期可以用已知滴度的阳性质控病毒来检验MDCK细胞系的敏感性。如果细胞的敏感性己经下降,&11 应复苏新的细胞栋。所用细胞系应确保无支原体污染。严3 ws 284-2008 A. 1
22、. 1. 1.8 l1DCK细胞翠的敏屉性的检测选择已细雨腔的11性质控人禽流.病毒,在同条件下分别感染早代(小于30-ft)的细胞株和现有的细胞株,对其进行TCID巧。测定。如果测试的TCID.5口比阜代的低2个戎以上19,表明其对病毒的敏感性己下降,不应继g使HL如果问者相差不超出一个19.表明可继续使用。A. 1. 1.2 人富流感情毒的良恒屹K细胞分离标准操作规程A. 1. 1.2. 1 试验材料a) T-25细胞阳已经75%-90%成片的MDCK细胞;b) TPCK处理膜酣(牛腆腺来服I型); c) HEPE:气援冲撞.lmol/L母准;d) D-MEM 1古养基;e)青霉素、髓霉京
23、母被00.0f)牛血泊白蛋白j:.H分V/l.叮A. 1. 1. 2. 2 培养a)细胞I古养b)病毒生每500mLE主曲的终站J且为6 分别沽洗细胞 边。1)百元菌的蒂掖管将情非细胞前岛由运品击据西培养i剧晴附:2)用无菌的蒋被管吸取2料纠H战生素等处理KL盹l阳谭嗣iIf置于细胞培养瓶中;3) 37.C吸附lh2h;的眼附后,Han.k扒;在沽洗细胞1&2式,然后加6mL吉2g/tnL TPCK-膜酶的病毒生长檀于细胞培养瓶中;5)放置于350C培养箱培养;的每日观事细胞病变情况(细胞病变的特征是细胞Blll月挂国化,细胞间隐士曾大。细胞核固捕或破裂三I严重时细胞部分或全部脱落)。c)细胞
24、培养l阔的收获1)当而对100%细胞出现病变时进行收在,收获之前可以将细胞陈融1!X2次,以提高收3d示本的病毒滴崖,即使无细胞病变也应该于第7天收在;ws 284-2008 引进行红细胞凝集试验(HA),HA滴度二三8的可ill行病毒的鉴在(JH在力古参见人寓波恩前毒的鉴定技术中的HAl式黯:归HI试验部分)r如投有红细M包i器集现象,继续传代i次。HA试验仍为阴性者,认为rI汇K细胞病毒分离阴性电标本按生物安全有关规定进行处理e对于HA豆8的细胞仕肖物地结进行细胞传代,在至HA注8月才再近千了病毒的鉴定辜挂传代2次以上,HA仍小于R的细胞分离物l飞可以采用RT-PCR或者Rel-TimeP
25、CR方陆进行核酸检恻。或用HI法时.1-亚型进行鉴定QA. 1.2 鸡旺分离人禽病毒方法A. 1.2. 1 试验材料a) 9日ili-j-ll日龄元特册病UCSPF汗割草;Db)照卵灯;c) 70% 75%酒精;d)一次性住时器i的玛卵jf于L器;的鸡胚分离程A. 1.2.2 人禽流曰所有有关人m物安全规定,严,毒分离的操作都睡任些物安耸巳皱实验室的生物y耸柜It1进行,必颁遵守叫丁面准操作规轩帮l岳王F物管理规定。进入生物安全三级到JEP宣誓求遵循生物安全实验室的个人!l:la)用照卵句出l电胚,标记出1电陡的气室与归b)如果吗;!l一唇副lE、没有变宿、有裂蝉,. . c)如何判血管=话胚
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