ENU与疾病动物模型ppt课件.ppt

ENUENU诱变与疾病动物模型诱变与疾病动物模型 邵义祥邵义祥人类遗传性疾病人类遗传性疾病u人类群体中约人类群体中约20%20%25%25%的人都患有不同种类、的人都患有不同种类、不同程度的遗传相关疾病。不同程度的遗传相关疾病。u人类遗传学研究表明：人类遗传学研究表明：4 45%5%新生儿患有遗传新生儿患有遗传病，病，40%40%的低智能儿童是由遗传因素造成。的低智能儿童是由遗传因素造成。u现代医学研究已证实：癌症、糖尿病、冠心病、现代医学研究已证实：癌症、糖尿病、冠心病、动脉粥样硬化、高血压病和精神分裂症等常见动脉粥样硬化、高血压病和精神分裂症等常见病与遗传因素密切相关。病与遗传因素密切相关。人类疾病动物模型的用途人类疾病动物模型的用途 由于个体遗传背景的差异及研究材料的限制，由于个体遗传背景的差异及研究材料的限制，人类遗传疾病的深入研究必须通过动物模型实人类遗传疾病的深入研究必须通过动物模型实现。现。u利用动物模型进行遗传疾病机理的深入研究利用动物模型进行遗传疾病机理的深入研究u借助动物模型进行实验性矫正或治疗借助动物模型进行实验性矫正或治疗获得人类遗传病动物模型的方法获得人类遗传病动物模型的方法u自发性动物模型自发性动物模型u基因组改造和修饰基因组改造和修饰u基因组诱变基因组诱变基因驱动法与表型驱动法基因驱动法与表型驱动法u基因敲除与插入基因敲除与插入基因驱动基因驱动 特点：基因结构明确；特点：基因结构明确；时间长，代价高，时间长，代价高，效率低。效率低。u诱导点突变诱导点突变表型驱动表型驱动 特点：高通量，大规模，表型明确；随机。特点：高通量，大规模，表型明确；随机。u小鼠是第二个完成全基因组测序的哺乳动小鼠是第二个完成全基因组测序的哺乳动物。物。u人类疾病有关的遗传基因中的人类疾病有关的遗传基因中的90%90%在小鼠在小鼠身上有相似的效果。身上有相似的效果。u小鼠容易获得，世代间隔短，饲养、管理、小鼠容易获得，世代间隔短，饲养、管理、实验操作方便。实验操作方便。小鼠是研究人类疾病和基因功能的最为理小鼠是研究人类疾病和基因功能的最为理想的模式动物，成为研究人类疾病和试验想的模式动物，成为研究人类疾病和试验新的治疗手段的理想模型。新的治疗手段的理想模型。小鼠在人类遗传病研究中的独特作用小鼠在人类遗传病研究中的独特作用ENUENU诱变技术诱变技术u随着越来越多的基因和微卫星标记被定位，突变基随着越来越多的基因和微卫星标记被定位，突变基因的定位也会随之变得容易，因此对小鼠进行化学因的定位也会随之变得容易，因此对小鼠进行化学诱变将越来越变得低成本而高效益。诱变将越来越变得低成本而高效益。uENUENU（ethylnitrosoureaethylnitrosourea）致突变技术是高通量大）致突变技术是高通量大规模筛选新基因及发育突变技术的化学诱变方法。规模筛选新基因及发育突变技术的化学诱变方法。uENUENU诱变是一种表型诱变技术，研究者无需知道哪诱变是一种表型诱变技术，研究者无需知道哪个基因以及这些基因的突变类型，即可直接针对某个基因以及这些基因的突变类型，即可直接针对某一未知基因突变导致的特定表型或疾病进行研究一未知基因突变导致的特定表型或疾病进行研究 ENU的的结构构（N-ethyl-N-nitrosourea）ENU诱变机制机制烷基化反应作用位点：A：N1、N3、N7 G：O6、N3、N7 C：O2、N3 T：O2、O4、N3复制、错配、未修复导致单碱基突变screening and testing for dominant mutantsscreening and testing for recessive mutants指标分类具体指标一般状况精神状态、体重、体形、营养状况神经行为步态、摇头、转圈、震颤、活动状况皮肤、毛发皮色、皮质、毛色、毛质、胡须、斑点、淤斑、纹理眼位置、大小、形态、颜色、角膜、虹膜、有无白内障耳耳廓位置、形态、大小、外耳道是否闭锁尾长短、粗细、形态、颜色骨骼头形、有无下颌、脊柱侧弯、四肢长短粗细、趾数多少，趾长短、并趾口腔牙齿长短、色质、质地、角度；舌的形态、色质；有无腭裂尿、粪尿液颜色、浑浊度；粪便颜色、质地血生化血糖、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素氮血常规白细胞数、红细胞数、血红蛋白、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量其它水肿、脑积水、腹水、脊柱裂诱变小鼠的筛查项目ENU诱变的历史和现状诱变的历史和现状 ENU诱变开始于上个世纪70年代，初期主要应用在肿瘤研究领域；在1985年左右，开始有报道用ENU诱变雄鼠而在后代当中获得突变系小鼠，这些突变小鼠某些酶的活性发生了改变；1995年以后，开始在世界范围内得到开展并主要用于基因功能的研究；1994年King等通过诱变获得生活规律异常的小鼠，1997年克隆了clock基因，这是表明ENU诱变技术独特优势的里程碑。国外进展德国GSF 1997-2003年期间共建立突变系小鼠267种，其中隐性突变50种，半显性突变5种，其余均为显性突变；到2000年英国MRC筛查突变小鼠26000只，得到突变系小鼠500种；到目前为止，世界上ENU诱变获得的突变系小鼠已有1000多种。国内进展南京大学和扬州大学共同承担的“国家小鼠遗传资源库”项目，其中一项重要工作就是开展小鼠ENU诱变研究。2002-2004年资源库共建立了具有自主知识产权的转基因/基因剔除/化学诱变小鼠共167种，其中ENU诱变获得的有117种，在此基础上克隆了7个突变基因。清华大学生物科学与技术系发育生物学实验室用ENU 诱导斑马鱼突变一共得到 35 种突变体。ENU诱变建立疾病动物模型诱变建立疾病动物模型 心血管疾病、代谢性疾病、神经系统疾病、免疫性疾病、肿瘤和出生缺陷等遗传高度相关性疾病已成为国际上生物医学研究的最热门领域，相应的实验动物学支撑，特别是相关疾病的动物模型的获得和建立成为了实验动物学研究的热点。小鼠疾病模型的开发与保种美国的Jackson实验室保存了近2500多个品系的小鼠模型；英国MRC的哺乳类遗传学中心保存了1000多个品系的小鼠资源；意大利的欧洲小鼠突变系保存中心每年以开发150个突变系小鼠的速度建立了数百个基因工程小鼠模型；日本的熊本大学实验动物资源开发研究中心(CARD)自2000年建立以来，已收集保存了700多个转基因和基因剔除小鼠模型。国家遗传工程小鼠资源库建立以来，已收集、开发了264种小鼠模型品系。模型种类包括：糖尿病模型、生殖缺陷模型、心衰模型、生长迟缓模型、骨密度异常模型、肢体发育缺陷模型、听力异常模型、眼发育异常模型、稀毛、毛色变异模型等等。目前，世界上数以千计新的小鼠品系，模拟人类代谢性疾病、自身免疫疾病、老年性疾病和神经系统疾病的动物模型正在不断通过ENU诱变这个高通量筛选技术建立起来，进而相关基因被定位和克隆。随着基因组计划的进行，从表型到基因克隆的方法目前也日渐成熟和简化。ENU在建立人类疾病动物模型和开展基因功能研究中的主要优势在相对短的时间内诱导产生较多的突变系小鼠，获得许多基因包括新基因的功能信息；只要得到能够遗传某种表型的突变小鼠，就可以通过配种形成任意控制的“超大家系”；小鼠近交系有数百种，其中12个品系的微卫星数据已经建库且免费开放，便于对突变基因的定位及克隆；小鼠与人类病理过程的相似性，通过克隆小鼠的致病基因就可以通过同源检索得到人类的相应疾病的基因；ENU诱变无需知道哪个基因以及这些基因的何种突变导致特定的表型或疾病，这也使得发现新基因成为可能。ENU诱导的某些突变，导致非致死的表型和改变蛋白质的部分功能，而不是完全废弃，因此增加了研究者鉴定突变体的机会，而该突变体含有对某个基因座的丰富信息。总之，以ENU诱变为手段，通过模式小鼠研究功能基因或人类疾病已成为一种很有前景的手段和捷径。我们的部分研究工作突变系小鼠的获得两种突变小鼠突变基因的定位两种突变小鼠模型性状的初步研究ENUENU诱变、突变表型筛选及诱变、突变表型筛选及遗传试验技术路线遗传试验技术路线ENUENUENUENU处理处理处理处理C57BL/6C57BL/6C57BL/6C57BL/6雄鼠雄鼠雄鼠雄鼠3 3 3 3个月后与同品系个月后与同品系个月后与同品系个月后与同品系母鼠配种母鼠配种母鼠配种母鼠配种子代小鼠（子代小鼠（子代小鼠（子代小鼠（G1G1G1G1）离乳离乳离乳离乳G1G1G1G1饲养至饲养至饲养至饲养至2 2 2 2月龄月龄月龄月龄阳性突变小鼠阳性突变小鼠阳性突变小鼠阳性突变小鼠G1G1G1G1同品系配种得同品系配种得同品系配种得同品系配种得G2G2G2G2具有亲代具有亲代具有亲代具有亲代G1G1G1G1突变表型突变表型突变表型突变表型显性遗传显性遗传显性遗传显性遗传突变基因的定位技术路线突变基因的定位技术路线B6B6突变系与突变系与DBA/2DBA/2交配，获得阳性表型的交配，获得阳性表型的F F1 1F1F1回交回交 DBADBA得到得到F2F2代代提取阳性表型的提取阳性表型的F2F2鼠鼠 尾尾DNADNA选择相关基因附近的微卫星优先连锁分析选择相关基因附近的微卫星优先连锁分析计算计算LODLOD值确定连锁值确定连锁u在在 G1 代小鼠中，代小鼠中，针对肉眼可肉眼可见的神的神经行行为、皮、皮肤、毛肤、毛发、五官、骨骼等可、五官、骨骼等可见表型表型筛查突突变个体。个体。筛查 G1 小鼠小鼠 1650只，只，获得突得突变小鼠小鼠 48 只。只。u在在对G1突突变小鼠的小鼠的遗传试验及突及突变系小鼠保种系小鼠保种过程中，繁殖小鼠程中，繁殖小鼠1468只，确只，确认能能够稳定定遗传的的只有只有短尾短尾短尾短尾、角膜角膜角膜角膜浑浊浑浊和和瞳孔异形瞳孔异形瞳孔异形瞳孔异形突突变小鼠等共小鼠等共 7 种，种，经卡方卡方检验都属于都属于单基因基因显性性遗传。小小 鼠鼠 的的 ENU ENU 诱诱 变结果变结果突变基因的微卫星定位体系D1Mit372、D1Mit84、D1Mit273、D2Mit6、D2Mit17、D2Mit528、D3Mit268、D3Mit15、D4Mit17、D4Mit54、D5Mit352、D5Mit168、D6Mit274、D6Mit339、D7Mit246、D7Mit333、D8Mit4、D8Mit320、D9Mit325、D9Mit243、D10Mit3、D10Mit73、D11Mit163、D11Mit258、D12Mit136、D12Mit17、D13Mit18、D13Mit262、D14Mit50、D14Mit205、D15Mit226、D15Mit34、D16Mit189、D16Mit100、D17Mit33、D17Mit39、D18Mit52、D19Mit128、D19Mit33。泳道泳道1：野生型野生型D2品系小鼠品系小鼠对照；照；泳道泳道 217：F2角膜角膜浑浊小鼠的小鼠的检测结果，其中第果，其中第9泳道泳道发生重生重组，其余，其余连锁。F2代代 B6角膜浑浊小鼠的微卫星检测角膜浑浊小鼠的微卫星检测角膜浑浊小鼠突变基因的连锁分析角膜浑浊小鼠突变基因的连锁分析角膜浑浊小鼠突变基因的染色体定位角膜浑浊小鼠突变基因的染色体定位D17Mit33与与D17Mit143聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳结果果 上上图：第：第4泳道泳道发生重生重组 下下图：无：无 1 例例发生交生交换，12、13、14分分别为D2、F1、B6 F2代代 短尾小鼠的微卫星检测短尾小鼠的微卫星检测短尾鼠的突变基因连锁分析短尾鼠的突变基因连锁分析228只只F2（B6D2）D2 109只短尾只短尾短尾突短尾突变基因与各微基因与各微卫星的星的连锁分析分析短尾小鼠突变基因的染色体定位短尾小鼠突变基因的染色体定位角膜浑浊突变小鼠的生物学角膜浑浊突变小鼠的生物学特性初步研究特性初步研究突变品系的建立及其模型性状突变品系的建立及其模型性状研究的技术路线研究的技术路线突变杂合子突变杂合子繁繁殖殖学学指指标标生生长长发发育育血血常常规规血血液液生生化化免免疫疫学学指指标标病病理理组组化化建立新的模型品系建立新的模型品系形形态态行行为为观观察察角膜浑浊小鼠角膜浑浊小鼠角膜浑浊小鼠和野生型小鼠的繁殖学指标比较角膜浑浊小鼠和野生型小鼠的繁殖学指标比较 角膜角膜浑浊小鼠后代的性小鼠后代的性别比比(:)为：1.07 有角膜有角膜浑浊表型的性表型的性别比比(:)为：1.44B6-CoB6-Co与正常与正常B6B6小鼠的脏器系数小鼠的脏器系数 角膜浑浊突变系与正常角膜浑浊突变系与正常B6B6小鼠血常规的比较小鼠血常规的比较 角膜浑浊突变系与正常角膜浑浊突变系与正常B6B6小鼠小鼠血液生化值的比较血液生化值的比较 角膜浑浊小鼠的角膜病理学特征（角膜浑浊小鼠的角膜病理学特征（1 1）角膜浑浊小鼠的角膜病理学特征（角膜浑浊小鼠的角膜病理学特征（2 2）角膜浑浊小鼠的角膜病理学特征（角膜浑浊小鼠的角膜病理学特征（3 3）角膜浑浊小鼠的模型价值角膜浑浊小鼠的模型价值 我我国国盲盲人人数数约670万万人人，角角膜膜浑浊是是仅次次于于白白内内障障的的主主要要致致盲盲原原因因（约占占15.4%）。人人类角角膜膜病病有有多多种种类型型，它它们的的致致病病原原因因更更有有许多多假假说，但但由由于于缺缺乏乏合合适适的的动物模型，相关研究一直未能深入。物模型，相关研究一直未能深入。突突变小小鼠鼠角角膜膜中中有有大大量量钙质和和异异物物沉沉积，类似似于于人人的的斑斑点点状状营养养不不良良，而而角角膜膜上上皮皮细胞胞和和基基质成成纤维细胞胞的的形形态学学变化化又又类似似于于人人的的先先天天性性角角膜膜化化生生症症。目目前前尚尚不不能能确确定定其其对应的的人人类角角膜膜病病类型型，但但遗传因因素素在在其其中中的的决决定定作作用用是是毫毫无无疑疑问的。的。对该小鼠的研究可能会小鼠的研究可能会对人人类角膜病的正确分型及角膜病的正确分型及发病机制提供科学理病机制提供科学理论依据。依据。短尾突变小鼠的生物学特性短尾突变小鼠的生物学特性初步研究初步研究短尾小鼠短尾小鼠后代尾巴后代尾巴的不同形态的不同形态短尾小鼠的繁殖学指标短尾小鼠的繁殖学指标 不同尾形小鼠的统计结果不同尾形小鼠的统计结果 各尾形所占百分比：短尾各尾形所占百分比：短尾 33.8%，中尾，中尾 9.9%，正常尾，正常尾 56.3%。性性别(:)比比值：0.75 脏脏 器器 系系 数数 比比 较较 表表血血 常常 规规 比比 较较 表表血血 液液 生生 化化 值值 比比 较较 表表短尾小鼠脏器系数、血常规、血液生化结果短尾小鼠脏器系数、血常规、血液生化结果短尾小鼠的脾、脑、子宫、卵巢的脏器系数与B6有显著差异。短尾小鼠白细胞、单核细胞显著高于B6。结果表明，短尾小鼠的血红蛋白、碱性磷酸酶、血清总蛋白、白蛋白、白蛋白、血清总胆固醇都显著低于B6小鼠。所获短尾小鼠属于纵形肢体缺陷，与人类心手综合征（holt-oram syndrome，HOS）属于同一类型，其突变基因与人类TBX5基因高度同源。心手综合征在人类的发病率约为十万分之一。短尾小鼠无疑是一个很好的骨骼畸形研究的动物模型。短尾小鼠的模型价值短尾小鼠的模型价值短尾突变基因（短尾突变基因（T T）的序列鉴定与分析）的序列鉴定与分析短尾突变基因序列鉴定与分析技术路线短尾突变基因序列鉴定与分析技术路线RT-PCRRT-PCRRT-PCRRT-PCR及巢式及巢式及巢式及巢式PCRPCRPCRPCR抽提抽提抽提抽提RNARNARNARNA胶回收测序胶回收测序胶回收测序胶回收测序测序结果比对测序结果比对测序结果比对测序结果比对确定突变位点确定突变位点确定突变位点确定突变位点基因组突变位点鉴定基因组突变位点鉴定基因组突变位点鉴定基因组突变位点鉴定实实 验验 方方 法法 8.5天小鼠天小鼠胚胎的获取胚胎的获取RNA抽提：抽提：参照参照 RNAR Total RNA Isolation System(Promega 公司公司)的说明书，在超净的说明书，在超净工作台内进行操作工作台内进行操作RT引物设计引物设计 逆转录：逆转录：参照参照 Invitrogen 公司公司 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒说明书操作试剂盒说明书操作 高保真高保真PCR扩增扩增PCR产物回收：产物回收：fastgene 胶回收试剂盒回收。胶回收试剂盒回收。收集滤液收集滤液,送上海生工测序。送上海生工测序。8.5天 B6-St 小鼠胚胎总 RNA RT-PCR扩增产物，得到了 1494 bp 的特异性产物 突变突变T基因基因RT-PCR产物电泳图产物电泳图T T基因、突变基因、突变T T基因的基因的cDNAcDNA序列与序列与数据库序列的比对数据库序列的比对 巢式 PCR 验证结果 1：正正常常小小鼠鼠胚胚胎胎T基基因因PCR电泳泳结果。果。2：短短尾尾小小鼠鼠胚胚胎胎T基基因因PCR电泳泳结果。果。正常小鼠和突变小鼠的正常小鼠和突变小鼠的巢式巢式PCRPCR测序结果比对测序结果比对 T T基因突变序列对应的基因组序列分析基因突变序列对应的基因组序列分析 基因组突变T基因扩增得到了 361bp 的产物正常正常B6B6和短尾小鼠基因组数据库和短尾小鼠基因组数据库DNADNA序列比对序列比对 结结 果果 实实验验证证实实了了我我们们所所获获得得的的短短尾尾小小鼠鼠T基基因因外外显显子子编编码码区区单单碱碱基基的的突突变变（T-A），造造成成了了 mRNA 缺缺失失67个个碱碱基基，使使T基基因因编编码蛋白功能活性丧失，导致短尾的产生。码蛋白功能活性丧失，导致短尾的产生。经经数数据据库库检检索索，尚尚未未发发现现有有第第2外外显显子子由由于于基基因因突突变变导导致致剪剪接接错错误误的的报报道道。因因此此，我我们们所所获获得得的的短短尾尾突突变变小小鼠鼠的的突突变变基基因是因是T 基因的一个新的等位基因。基因的一个新的等位基因。数量性状基因突变谢谢大家！敬请批评指正！