毕业设计(论文)人参皂苷糖基水解酶的研究.pdf
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1、大连理工大学博士学位论文题目名称人参昔糖基水解酶的研究计:学位论文117表 格 17插 图 48学位论文完成日期:2002年6月20 口博士生:张春枝专业:生物化丁评阅人:_指导教师:安利佳金凤燮教研室主任:_院(系)主任:安利佳Ph.D.Thesis of Dalian University of TechnologyGinsenoside glycosidases fi-om panax ginsengZhang ChunzhiA Thesis Submitted to Dalian University of Technology for the Degree of Ph.D.Super
2、vised by Prof.An Lijia Prof.Jin FengxieJune 20,2002大连理L大学博士学位论文摘要本文以专一水解人参皂甘特定糖基为付的,进行了人参皂仔糖基水解解的分 离纯化、性质研究、以及人参皂苛Rg3和Rc的定向酶解反应,证明了酶法定向 改造人参皂昔结构的可能性.采用缓冲液抽提、硫钱沉淀、离子交换层析法从人参根中分离纯化了两种人 参皂俘楣基水解酶 人参皂伴小葡萄糖价酶和人参电伊七-阿拉伯糖俘酹。人 参皂甘-B-葡萄糖普酶被纯化厂16倍,收率为14.4%,人参皂甘-比阿拉伯糖仔融 被纯化了18.5倍,收率为4.6%,PAGE检测纯化后的前为单一谱带.人参皂甘-P
3、葡萄糖昔酶能水解人参皂甘Rg3生成人参皂音Rh2.最适作用温 度为55-60C,最适pH为5.0,Ca-对该酶有激活作用,Cu有抑制作用.该酶 在60C以F,pH4.0-7.0稳定,SDS-PAGE测得分子量为59kDa。此酶N-端赛基 酸序列为SLDANYVPKYVTLPL,与已知序列的。-偏萄糖甘酶无同源性,人参皂 苜-P-葡萄糖甘酶在水解特性上也不同于传统的B-葡萄糖甘酶(EC3.2.1.21)。本 文还建立了人参皂昔-0-前萄糖昔的催化Rgj反应的米氏方程。人参皂昔-a阿拉伯糖昔醉能水解人参皂甘Rc生成人参皂仔Rd,最适作用温 度为50*C,最适pH为5.0.CiL对酶有抑制作用。该旃
4、在60*C以下,pH4.0 6.0 稳定,SDS-PAGE测得分子量为86kDa.人参皂甘糖基水解酶在底物浓度10mg/ml,pH5.0,55X7的条件下水解人参电Rgo反应24h,Rg3的转化率可达到60%。经饱和正丁醇萃取,硅胶柱分离,酶解产物Rh?纯度可达90%,得率为32%。人参皂昔平-葡萄糖昔醐能水解20(S)Rg3和20(R)Rgj分别生成20(S)-Rh?和20(R)-Rh2,水解速度大体相同。核磁共 振【HNMR、CNMR)和质谱(MS)检测结果显示,醉解20(S)Rgj所得产物 为20(S)-Rh2.系统名称为30-D-毗喃轴萄糖基)-达玛-24-烯凸乐12p,20(S)-H
5、 醉;酶解20(R).Rg3所得产物为2O(R)-Rh2,系统名称为3.0.(BD-毗喃葡萄糖基)-达玛-24.烯-3d12P,20(R)三醵,分子式为C36H62。8,分子量为622。人参皂甘糖基水解醇在底物浓度30mg/ml,pH5O 50c的条件下水解人参空 计Rc,反应24h.Rc的转化率可达到60%.经饱和正丁醇萃取,硅胶柱分离,陶解产物Rd纯度可达90%.得率为34%,核磁共振(*HNMR.nCNMR)和质 谱(MS)检测结果表明,酶解产物为20(S)-人参皂昔Rd,系统名称为3-CH0-D-毗喃葡萄糖基(1-2)MD.毗喃葡萄糖基A 200邓D4tt喃葡萄糖基)-达玛-摘 要烯邢
6、,】2120(S)三爵,分子式为C48H心(力8,分子量为946.本文在证明酶法定向转化人参皂开制备稀有皂苗可行性的同时,为深入研究 糖若水解酶尤其是皂甘糖基水解醵奠定了一定的实验基础。关键词,人参皂昔呻-葡萄糖昔薛,人参皂昔-a-阿拉伯精昔醇,人叁皂昔糖基水 解醒,薛纯化,薛水解.人身皂昔Rh人叁皂昔Rd大比理丁大学媳士学位论文AbstractIn order to hydrolyze the ginsenosides specifically,the ginsenoside-P-glucosidase and the ginsenoside-a-arab inofurana$c are p
7、urified,characterized,and ginsenoside Rg?and Rc are hydrolyzed b y the enzymes as well.It shows the possib ility of hydrolyzing ginsenosides specifically.The ginsenoside-p-glucosidase and the ginsenoside-a-arab inofuranase from ginseng root are purified to one spot in PAGE b y b uffer extraction,(NH
8、4)2SO4 precipitation and ion exchange chromatography.The ginsenoside-p-glucosidase hydrolyzes the ginsenoside Rgj sugar moiely to ginsenoside Rh?.The optimal temperature is 55-60,and the optimal pH is 5.0.Ca2 ion has the positive effect,while has the negative effect on it.Its molecular weight is ab
9、out 59 kDa in SDS polyacrylamide gel electrophoresis.The N-er)d sequence of ginsenoside-P-glucosidase is SLDANYVPKYVTLPL,which has no homology with the P-glucosidases whose protein sequence are known.The hydrolysis of ginsenoside-P-glucosidase is different from the original exocellulase such as P-gl
10、ucosidase(EC3.2.I.21).In addition,the Michael is-Mcntcn model of ginsenoside-P-glucosidase is b uilt.The ginsenoside-a-arab inofuranase hydrolyzes the ginsenoside Rc to ginsenoside Rd.Ihe optimal temperature is 50C,and the optimal pH is 5.0.Cu?*inhib ites the enzyme activity.Its molecular weight is
11、ab out 86 kDa in SDS polyacrylamide gel electrophoresis.In hydrolyzing ginsenoside Rga to Rh2 b y(he saponin glycosidases,the conversion rate is 60%in the condition of sub strate Rg3 lOmg/ml,pH5.0,55C,24h.After b utanol extraction and separation on the silica gel column,the purity of the product Rh
12、is ab out 90%and the yield is 32%.The ginsenoside-P*glucosidase can hydrolyze b oth 20(S)-Rgj and 20(R)-Rg3 to form 20(S)-ginsenoside Rh:,i.e.3-O-(p-glucopyranosyl)-dammar-24-en-3p,12(3,20(S)-triol and 20(R)-ginsenoside Rhj,i.c.3-0-(p-glucopyranosyl)-dammar-24-en-3p I2p,20(S)-triol respectively,acco
13、rding to the data of the IHNMR,13CNMR and MS.The reaction rate of 20(S)-Rg3 and 20(R)-Rgj is nearly the same.AbstruttIn hydrolyzing ginsenosidc Rc to Rd b y the ginsenoside-a-arab inofuranasc,the conversion rate is 60%in the condition of sub strate Rc 30mg/ml,pH5.0.50c.24h.?fier b utanol exiraction
14、and separation on the silica gel column,the purity of the product Rd is ab out 90%and the yield is 34%.The product from Rc is 20(S)-Rd.i.e.3-0-(P-glucopranosyl-(1-2)-P-lucopyranosyl)-20-O-(p-glucopyranosyl)-dammar 24-en-3p,12(3.20(S)-triol according io the data of the NMR,3CNMR and MS.All this prove
15、s the possib ility of transforming ginsenosides into the rare ginsenosides.It also lays a foundation on studying glycosidase especially saponin glycosidase further.Key Words:oinsenoside-p-glucosidase,ginsenoside-a-arab inofuranase,saponin glycosidases,enzyme purification and characterization,enzyme
16、hydrolysis,ginsenoside Rli:,ginsenosidc Rd人过理工大学博上学位论文目 次摘要.【Ab stract.11!前言.I第一章文献综述.31.1 人参及其有效成分.31.1.1人参的种类.3I.1.2人参的有效化学成份.41.2 人参皂昔的结构与性质.41.2.1人参皂昔的分类及其化学结构.412.2人参皂苛的性质.7L 3人参皂音的分析分离与鉴定.81.3.1人参皂昔的分隔提取方法.81.3.2 人参皂昔的分析方法.91.3.3 人参皂昔的结构测定.91.4人参皂昔的药理作用.101.4.1人参皂甘的抗疲劳作用.101.4.2人参轻音的延缓衰老作用.111
17、.4.3人参皂昔的增强免疫力作用.121.4.4人参皂件的改善心血管和血液循环作用.131.4.5人参皂甘的抗肿瘤作用.14L 5皂昔的结构改造.151.5.1皂甘糖基与生物活性的关系.151.5.2皂昔糖基改造的研究方法.161.5.3酶法改造人参皂甘糖基提高其活性的研究.171.6 酶学研究的基本方法.181.6.I酶的分类.181.6.2酶分离纯化的基本方法.191.6.3酶性质的一般研究内容及方法.251.6.4酶结构的一般研究内容及方法.2r1.7 人参事昔的国内外研究现状及本文研究的内容.2目次1.7.1 人参皂好的国内外研究现状.281.7.2 本文研究的内容.29第二章人参皂昔
18、糖基水解酶的分离纯化.312.1引言.312.2材料与方法.322.2.1实验材料.322.2.2实聆方法.332.3结果与讨论.352.3.I人参皂甘邛-葡萄糖昔酶的分离纯化.352.3.2人参皂昔-or阿拉伯糖在酶的分离纯化.372.3.3高效液相蛋白制备色谱进 步纯化人参皂俘时葡萄糖背酣.392.3.4的纯度的鉴定.402.4小结.41第三章人参皂昔糖基水解酶的性质.423.1引言.423.2材料与方法.423.2.1实验材料.423.2.2实验方法.433.3结果与讨论.453.3.1 人参皂参呻-葡萄糖昔簿的部分性质.453.3.2 人参皂甘-a-阿拉伯糖昔酶的部分性质.503.3.
19、3人参皂甘邛-筒萄糖昔的催化反应动力学.543.3.4人参皂昔邛-葡萄糖首前的N-端序列测定.553.4小结.58第四章人参皂昔糖基水解酶的催化作用.594.1引言.591.2材料与方法.594.2.1实验材料.591.2.2实验方法.604.3 结果与讨论.614.3.1不同来源。-葡萄糖源酶催化水解标准底物.614.3.2不同来源。-葡萄糖甘酶催化水解人参皂昔Rgs.6,4.3.3人参皂昔-a-阿拉伯糖昔酶的催化作用.6,大连理T人学慨十学位论文4.4小结.65第五章 酶法水解人参皂昔Rgj制备稀有皂昔Rh?.675.1 引言.:.675.2 材料与方法.685.2.1 实验材料.685,
20、2.2 实验方法.695.3结果与讨论.705.3.1酶液的大量制备.705.3.2酶水解人参皂仔Rgi生成Rhz反应条件的确定.705.3.3 20(S)-Rg3和 20(R)-Rg?的酶水解.725.3,4醐解产物人参皂昔Rhi的分离纯化.735.3.5酶解产物的分析鉴定.755.4 小结.82第六章酶法水解人参皂甘Rc制备人参皂昔Rd.846.1 引言.846.2材料与方法.856.2,1实验材料.856.2.2实验方法.856.3结果与讨论.866.3.1酶液的大量制备.866.3.2水解人参皂音Rc生成Rd反应条件的确定.876.3.3人参皂甘Rc的酶水解.896.3.4酶解产物Rd
21、的分离纯化.896.3.5酶解产物的分析鉴定.916.4 小结.94第七章结论与展望.967.1 结论.967.2 本论文的创新点.987.3 有待深入的内容.98参考文献.101附录.”3攻读博士学位期间发表的论文.115创新点摘要.11iil致谢117人连理丁大学博匕学位论文ContentsChinese Abstract.IAbstract.IllPreface.1Chapter 1 Review.31.1 Ginseng and its active components.3L 1.1 Species of ginseng.31.1.2 Active components in gin
22、seng.41.2 Structure and character of ginsenosides.41.2.1 Structure and classification of ginsenosides.41.2.2 Character of ginsenosides.7I.3 Separation and analysis of ginsenosides.81.3.1 Separation methods of ginsenosides.8I.3.2 Analysis methods of ginsenosides.91.3.3 Structure determinalion of gins
23、enosides.9L 4 Pharmacological activities of ginsenosides.101.4.1 Anti-faiigue actions of ginsenosides.101.4.2 Postponing decrepitude actions of ginsenosides.111.4.3 Enhancing immunity actions of ginsenosides.121.4.4 Improving b lood cycle actions of ginsenosides.131.4.5 Anti-cancer actions of ginsen
24、osides.14I.5 Stmcture modification of saponin.151.5.1 Relationship b etween saponin glycosyl structure and activities.151.5.2 Study methods of modifying saponin glycosyl structure.161.5.3 Study on modifying saponin glycosyl b y Enzyme.171.6 Common methods in enzymology study.181.6.1 Classification o
25、f enzyme.181.6.2 Common methods in enzyme purification.191.6.3 Contents and methods in enzyme character study.251.6.4 Contents and methods in enzyme structure study.271.7 Studies on ginsenosides in the world and the studies in this text.2Contents1.7.I Studies on ginsenosides in the world.281.7.2 Stu
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