绿原酸不同位置不同程度乙酰化物的制备及其生物活性研究.pdf
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1、内蒙古大学倾I.学位论文学校代码:10126分类号:_学号:31408130编号:_论文题目绿原酸不同位置不同程度乙酰化物的 制备及其生物活性研究学 院:生命科学学院专 业:生物工程研究方向:天然药物与功能食品 万方数据内蒙古大学硕士学位论文原创性声明本人声明;所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。除本文已经注明引用的内容外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得内蒙古大型及其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示谢意。在学期间研究成果使用承诺书本学位论文作者完全
2、了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:内蒙 古大学有权将学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学 位论文的复印件和磁盘,允许编入有关数据库进行检索,也可以采用影印、缩 印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权,作者 在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研 究内容或研究成果,须征得内蒙古大学就读期间导师的同意;若用于发表论文,版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。万方数据内蒙古大学硕士学位论文绿原酸不同位置不同程度乙酰化物的制备及其生物活性研究摘要天然产物的开发与利用一直占据着药物发展史的重要地位。天 然产物在临床
3、用药中仍占有很大比例。许多天然产物本身具有良好 的生物活性,但是因为其结构的特殊性难以在生物体内发挥其重要 的生物活性作用,因此需要通过化学修饰的手段,对一些天然药物 产物的结构加以修饰改造使其能够发挥更大的作用。绿原酸是一类在自然界中广泛分布的天然产物,它是植物的次 生代谢产物,生物活性广泛。目前对于绿原酸的研究主要集中于植 物化学分离提取与药理活性方面。本论文选取绿原酸(50-咖啡酰奎宁酸)和绿原酸的戊酮缩合 物为原料,将原料在醋酸酎/口比咤体系中进行全乙酰化,再利用酸、碱、酶水解制备出了 1 乙酰绿原酸,1,3-二乙酰绿原酸,1,3,4.三乙 酰绿原酸以及1,3,43-四乙酰绿原酸。三种
4、水解条件下,酚羟基的乙 酰基均先于奎宁酸部分的醇羟基上的乙酰基被水解;酸、碱对C-3,C-4位上的乙酰基水解进程接近,实验过程中得到1,3-二乙酰绿原酸 与1,4二乙酰绿原酸;位的乙酰基最稳定。用酸、碱、酶三种水 解条件均制备出了 1,3,4,三乙酰绿原酸。其中,酶法水解对酚羟基 上的乙酰基有高度选择性,反应速率快,产物单一,后处理简单,所以酶法制备1,3,4,-三乙酰绿原酸是最理想的选择。生物活性实验 结果表明,部分-0H被乙酰化的绿原酸衍生物仍具有绿原酸分子本 I万方数据内蒙古大学硕士学位论文身清除DPPH自由基的能力,而五乙酰化绿原酸则不具备此能力。1,3,4.三乙酰化绿原酸与1,3,4
5、3-四乙酰化绿原酸对被叔丁基过氧化 氢损伤的HepG2细胞具有保护作用。1,7-(3-戊酮卜绿原酸缩酮与1,7-(3-戊酮3,4,3:4,-四乙酰绿原酸缩酮可有效地抑制HepG2细胞的增殖。以上研究结果表明对绿原酸及其衍生物不同位置上的羟基进行不同 程度的乙酰化修饰可制备具有不同活性的衍生物。关键词:天然产物;绿原酸;乙酰化;衍生物;生物活性II万方数据内蒙古大学硕士学位论文SYNTHESIS AND BIOACTIVITY INVESTIGATION OF CHLOROGENIC ACID DERIVATIVES WITHDIFFERENT ACETYLATION DEGREES ATDIF
6、FERENT POSITIONSABSTRACTDev elo pment a nd utiliza tio n o f na tura l pro d uc ts h a s been o c c upy ing a n impo rta nt po sitio n in th e h isto ry o f d rug d isc o v ery.A la rg e pro po rtio n o f presently used c linic a l d rug s a re na tura l pro d uc ts a nd th eir d eriv a tiv es.Ma ny
7、 na tura l pro d uc ts th emselv es h a v e g o o d in v itro bio lo g ic a l a c tiv ities.Ho wev er,th e spec ia l na ture o f th e struc tures o f so me na tura l pro d uc ts h a mpered th em to d ispla y bio a c tiv ities in v iv o.Th erefo re,it is impo rta nt to mo d ify th e c h emic a l stru
8、c tures o f th ese na tura l pro d uc ts by c h emic a l o r bio lo g ic a l mea ns in o rd er to impro v e th eir in v iv o bio a c tiv ity.Ch lo ro g enic a c id,a pla nt sec o nd a ry meta bo lite,is wid ely d istributed in na ture.It h a s numero us ex c ellent bio a c tiv ities,suc h a s free r
9、a d ic a l sc a v eng ing,a ntisepsis a nd a nti-infla mma tio n,a nti-v ira l,a nti-d ia betes,h y po lipid emic,a nd h epa to pro tec tiv e.Up till no w,mo st resea rc h es o n c h lo ro g enic a c id h a v e been fo c used o n th e iso la tio n,purific a tio n a nd ph a rma c o lo g ic a l inv es
10、tig a tio n o f th is c o mpo und fro m pla nts.Th e present resea rc h wa s c a rried o ut to use c h lo ro g enic a c id(5-0-c a ffeo y lquinic a c id)o r its penta keta l d eriv a tiv e a s sta rting ma teria ls to prepa re th eir a c ety la ted d eriv a tiv es a nd to inv estig a te th e bio a c
11、 tiv ities o f th e prepa red d eriv a tiv es.Pera c ety la ted d eriv a tiv es were o bta ined by trea tment o f th e sta rting ma teria ls with a c etic a nh y d rid e/py rid ine.Hy d ro ly zing pera c ety la ted c h lo ro g enic a c id with HC1,Na 2c O3 o r lipa sein 万方数据内蒙古大学硕上学位论文to o bta in 1-
12、a c ety l c h lo ro g enic a c id,1,3-d ia c ety l c h lo ro g enic a c id,1,3,4-tria c ety l c h lo ro g enic a c id a nd 1,3,4,3-tetra a c ety l c h lo ro g enic a c id.In th ese th ree h y d ro ly sis c o nd itio ns,Und er th ese c o nd itio ns,th e a c ety l g ro ups in th e ph eno lic h y d ro
13、x y l were mo re ea sy to be h y d ro ly zed th a n th o se in th e a lc o h o lic h y d ro x y l o f quinic a c id pa rt;Th e a c ety l g ro ups a t po sitio n 3 a nd 4 were simila rly sensitiv e to th e h y d ro ly sis c o nd itio n using HC1 o r Na 2c o3,c o mpo und s 1,3-d ia c ety l c h lo ro g
14、 enic a c id a nd 1,4-d ia c ety l c h lo ro g enic a c id being fo und in th e ex perimenta l pro c ess;Th e a c ety l g ro up a t C-l wa s th e mo st sta ble.Co mpo und 1,3,4-tria c ety l c h lo ro g enic a c id wa s o bta ined in a ll th e th ree h y d ro ly sis c o nd itio ns with HC1,Na 2c O3 o
15、 r lipa se.Lipa se wa s th e mo st selec tiv e in h y d ro ly sis o f th e a c ety l g ro ups a t th e ph eno lic h y d ro x y s.In a d d itio n,th e enzy me h y d ro ly sis wa s fa st to o bta in a sing le pro d uc t,wh ic h ma d e th e po st purific a tio n pro c ess simple,so lipa se h y d ro ly
16、sis o f pera c ety la ted c h lo ro g enic a c id wa s a id ea l meth o d to prepa re 1,3,4-tria c ety l c h lo ro g enic a c id.Th e bio a ssa y results sh o wed th a t th e pa rtia l a c ety la ted c h lo ro g enic a c id d eriv a tiv es ma inta ined th e a bility to sc a v eng e DPPH free ra d ic
17、 a l wh ile fiilly a c ety la ted c h lo ro g enic a c id a nd fully a c ety la ted keta l d eriv a tiv es d id no t h a v e th is a bility.Ac ety la ted c h lo ro g enic a c id d eriv a tiv es sh o wed pro tec tio n o f o x id a tiv e d a ma g ed o n HepG2 c ells.Th e l,7-(3-penta no ne)-3,4,3,4-te
18、tra a c ety l c h lo ro g enic a c id keta l sh o wed po tent inh ibito ry a c tiv ity o n th e pro lifera tio n o f HepG2 c ells.So a c ety la tio n o f c h lo ro g enic a c id o r its keta l d eriv a tiv es a t d ifferent po sitio ns in d ifferent d eg rees c o uld result in c h emic a l c o mpo u
19、nd s o f d ifferent bio a c tiv ities.Keywords:na tura l pro d uc ts;c h lo ro g enic a c id;a c ety la tio n;sy nth esis;bio lo g ic a l a c tiv ityIV万方数据内蒙古大学硕士学位论文目录第一章综述二.11.1 绿原酸简介.11.2 绿原酸国内外的研究进展.11.2.1 绿原酸的发现和命名、化学结构和理化性质.11.2.2 绿原酸的分布.2123绿原酸的合成.31.23.1 绿原酸的可能生物合成途径.31.23.2 绿原酸的化学合成研究进展.41.
20、3绿原酸 的生物活性.5131抗氧化作用.5132抑制突变和抗肿瘤作用.5133对透明质酸酶与葡萄糖磷酸位移酶的抑制作用.6L3.4抗菌、抗病毒等作用.613.5其它生物活性.61.4绿原酸的应用前景.7L5本课题研究意义.8第二章五乙酰化绿原酸的合成及部分水解产物的制备.92.1 设计合成路线.92.1 实验试剂与实验设备.102.1.1 实验试剂.102.1.2 实验设备.112.2 实验方法.112.2.1 1,3,4,3;率五乙酰绿原酸的合成(见合成路线1).112.2.2 1,3,4-三乙酰绿原酸的制备(见合成路线2).12万方数据内蒙古大学硕士学位论文2.2.3 1-乙酰绿原酸的合
21、成(见合成路线3).132.2.3.1 正交实验确定酸水解条件.132.23.2 1-乙酰绿原酸的制备与纯化.142.2.4 1,3二乙酰绿原酸的制备(见合成路线4).16225 1,3,43四乙酰绿原酸的制备(见合成路线5).172.3 酶催化水解实验.182.3.1 酶催化水解制备1,3,4-三乙酰绿原酸.182.4 结果分析与讨论.20第三章绿原酸缩粥类乙酰化物的制备.223.1 实验原料的来源及鉴定.223.2 1,7-(3-戊朗)-3,4,3:4:四乙酰绿原酸缩酮的合成.233.3 结果分析与讨论.24第四章绿原酸衍生物活性的测定.254.1 抗氧活性的测定.264.1.1 DPPH
22、法测定抗氧化活性的实验原理.264.1.2 实验试剂与实验设备.274.1.3 实验方法.274.1.4 实验结果与分析.284.3小结.29第五章细胞毒性及抗氧化实验.305.1 细胞培养.305.1.1 实验试剂及实验设备.305.1.2 培养基的配制.305.1.3 复苏细胞及培养.31VI万方数据内蒙古大学硕士学位论文5.2 MTT法检测绿原酸及其乙酰化物对HepG2的细胞毒性.315.2.1 实验原理.315.2.2 实验试剂与实验设备.二.315.2.3 实验方法.325.2.4 实验结果与分析.325.3 绿原酸及其乙酰化物对HepG2细胞内ROS水平的影响.335.3.1 实验
23、试剂与实验设备.335.3.2 实验方法.335.3.3 实验结果与分析.345.4 小结.34第六章总结.35参考文献.36附图.39致谢.45VII万方数据内蒙古大学硕士学位论文第一章综述1.1 绿原酸简介绿原酸(Ch lo rig enic a c id)别名咖啡糅酸,是植物细胞有氧呼吸过程中经 过HMP途径(磷酸戊糖途径)的中间代谢物合成的一种苯丙素类化合物,是 酚类化合物的典型代表。科学家Hulme口于20世纪50年代从苹果中分离提取 出了绿原酸,随着人们对绿原酸生物活性的深入研究,人们给以绿原酸更高的 关注。大量研究结果表明:绿原酸具有多种生物活性,例如抗菌、抗病毒、保 肝利胆、抗
24、肿瘤、降血压、降血脂以及抗氧1化等。除了以上的药理作用,绿 原酸还是非常重要的工业原料,常常作为高级化妆品的添加剂、植物生长激素 以及食品添加剂来使用。图1.1绿原酸化学结构Figure.1.1 T he chemical structure of chlorogenic acid1.2 绿原酸国内外的研究进展121绿原酸的发现和命名、化学结构和理化性质1897年Ca mpbell和Osbo me在向日葵籽中共同发现了一种名为:h eli-a nth o ta nnic a c id的物质,该物质是引起向日葵籽蛋白变黑的根本原因。Go rter等 人于1909年确认该化合物为绿原酸。1947年
25、,Nelso n和Rud kin两位科学家初 次确定了绿原酸的化学结构,即奎尼酸与咖啡酸缩合而成的一种酯。绿原酸,淡黄色的固体,化学名5-0-咖啡酰奎尼酸(5-O-c a ffeo y lquinic a c id),分子式G6Hl8。9,相对分子质量354.30,熔点208C,25时在水中的 溶解度为4%。绿原酸可溶于乙醇、丙酮,微溶于乙酸乙酯,在氯仿、乙醛、苯 等亲脂性的有机溶剂中溶解度较差。万方数据内蒙古大学硕士学位论文122绿原酸的分布绿原酸广泛分布于植物中,无论是在高等的双子叶植物还是低等的藤类植 物中均含有该物质,特别是在葵花籽仁、粕、可可豆、咖啡豆、沙棘果以及金 银花、杜仲等传统
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- 绿原酸 不同 位置 程度 乙酰化 制备 及其 生物 活性 研究
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