DB15∕T 3147-2023 番茄颈腐根腐病病原菌鉴定规程(内蒙古自治区).pdf
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1、 ICS 65.020 CCS B 16 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 31472023 番茄颈腐根腐病病原菌鉴定规程 Technical code of practice for identifying pathogen of fusarium crown and root rot in tomato 2023-08-25 发布 2023-09-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 31472023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治
2、区农业标准化技术委员会(SAM/TC 20)归口。本文件起草单位:内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古农业大学。本文件主要起草人:杨永青、刘燕、高婧、张磊、宋培玲、皇甫海燕、贺小勇、史志丹、孙琴霞、张欣昕、李秀萍、莎娜。DB15/T 31472023 1 番茄颈腐根腐病病原菌鉴定规程 1 范围 本文件规定了番茄颈腐根腐病样品采集分离和保存、病原菌的致病性测定、病原菌的鉴定方法、结果判定的技术要求。本文件适用于番茄颈腐根腐病病原菌的室内鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,
3、其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 2589 植物病原真菌检测规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。番茄颈腐根腐病 fusarium crown and root rot 由尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici,FORL)引起的一种土传病害,主要症状表现为在土壤与植株茎基部交接处、环绕茎基部有明显的深褐色病斑,染病植株直立但长势明显缓慢且下部叶片出现变黄、萎蔫的症状,病株的主根、侧根严重褐变、腐烂脱落,维管束褐变,被侵染的植株在35片叶的幼苗期从发病部位折倒而萎蔫死亡。致病性 pat
4、hogenicity 病原物所具有的损害寄主并引起病害的特性。4 鉴定依据 以番茄颈腐根腐病发病症状、病原菌形态学特征、PCR 产物及测序结果等为鉴定依据。番茄染病植株的发病症状及尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型的形态学特征参见附录 A。5 主要仪器和试剂 主要仪器 DB15/T 31472023 2 高压灭菌锅、超纯水系统、恒温培养箱、超净工作台、光学显微镜、高速冷冻离心机、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统、旋涡振荡器、电子天平等。主要试剂 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)、绿豆琼脂培养基(绿豆粉 6 g,琼脂粉 4 g,溶于 200 mL 蒸馏水);真菌基因
5、组提取试剂盒、2PCR Mix、琼脂糖、50TAE 电泳液、DL2000 DNA Marker,次氯酸钠、无水乙醇、硫酸链霉素等均为国产分析纯试剂。6 样品采集、分离和保存 样品采集及分离 在番茄种植地采集疑似病株,用于病原菌的分离,冷藏保存备用,同时记录采样地点和时间。按照 SN/T 2589 进行发病组织分离培养,将表面消毒的 10 个组织块置于 PDA 平板(含 500 g/mL硫酸链霉素),于 25 恒温培养。5 d 后待培养皿中组织块周围长出菌丝,从菌落边缘挑取少量菌丝体和分生孢子置于无菌水中制成分生孢子悬浮液,取 100 L 涂布于 PDA 培养基,连续纯化 23 次获得病原菌的纯
6、培养物。以“年份-采样地-序号”进行编号,备用。菌种保存 在长满菌丝的 PDA 培养基 3/4 处,用打孔器取直径为 5 mm 的菌丝块,装入 1.5 mL 的无菌离心管或菌种保存管中(48 个菌丝块/管),加入 1.0 mL2.0 mL 已灭菌的 40%甘油或 20%二甲基亚砜,液氮速冻后-80 低温冰箱中保存 612 个月;或将病原菌的 PDA 平板用封口膜密封,保存于 4 8 冷藏 12 个月。7 病原菌的致病性测定 种子处理及育苗 播种前,种子放入 50 55 的温水中浸种 15 min20 min,基质提前在 105 烘箱中干热处理 2 h,使用灭菌基质在 72 孔穴盘中育苗。病原菌
7、回接 病原菌于 PDA 平板上活化培养 5 d,接种于马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中,25、150 r/min振荡培养 7 d,4 层无菌纱布过滤,用血球计数板计数并调节孢子液浓度至 1107 个/mL;番茄幼苗长至 34 叶期,每株幼苗根系周围灌入 30 mL 孢子液,同一病原菌接种 10 株番茄幼苗,以接种无菌水的5 株幼苗为对照。置于 20 2、16 h 光照/8 h 黑暗人工气候室中。接种 30 d 后,观察并记录发病情况。若植株发病症状与田间症状一致,需从发病植株上再次分离、鉴定病原菌。8 病原菌的鉴定方法 形态学鉴定 25 恒温条件下培养 7 d,病原菌在 PDA 培养基或绿豆
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