DB53∕T 1145-2023 切花百合病毒种类高通量鉴定和检测技术规程(云南省).pdf
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1、ICS 65.0 20.0 1CCS B16B53云 南 省 地 方 标 准DB53/T 114520 23切花百合病毒种类高通量鉴定和检测技术 规程20 23-0 2-23 发布20 23-0 5-23 实施云南省市场监督管理局 发布DB53/T 114520 23前 己本文件按照GB/T 1.1-20 20标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南大学提出。本文件由云南省花卉标准化技术委员会(YNTC 08)归口。本文件起草单位:云南大学、宁波大学。本文件主要起草人:王建光、彭杰军、陈
2、剑平、燕飞、鲁宇文、郑红英、吴官维、饶绍飞。IDB53/T 114520 23切花百合病毒种类高通量鉴定和检测技术规程1范围本文件规定了切花百合病毒种类高通量鉴定和检测的术语和定义、样品采集与处理、切花百合病毒 种类高通量鉴定和检测方法以及结果判定的技术要求。本文件适用于已报道的切花百合病毒种类的鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。GB/T 28071黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法GB/T 30989高通量基因测序技术规程G
3、B/T 35537高通量基因测序结果评价要求GB/T 35890高通量测序数据序列格式规范GB/T 40664用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求NY/T 402脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程NY/T 1744切花百合脱毒种球3术语和定义GB/T 309892014、GB/T 358902018、GB/T 40 6642021 及NY/T 17442009界定的以及下列术 语和定义适用于本文件。为了便于使用,以下重复列出了GB/T 309892014、GB/T 358902018、GB/T 40 6642021及NY/T 17442009中的某些术语和定义。3.1切花百合病毒病 cu
4、t I i l y v i rus disea ses指由单一或复合病毒侵染百合植株造成植株矮化、花朵变小;叶片花叶、褪绿、斑驳、规则或不规 则坏死斑、畸形等疑似病毒为害症状的病害。来源:NY/T 174420 0 9,4.23,有修改3.2高通量测序 h i gh-throughput sequenc ing又称“下一代测序技术”(Next-genera tion sequencing technol ogy),区别于传统双脱氧测序,是指一种能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术,通常一次测序反应能产生不低于100 Mb的测序数据。来源:GB/T 30 98920 14,7.24,
5、有修改3.3测序片段rea ds1DB53/T 114520 23高通量测序平台产生的含有碱基序列和质量值的序列片段。来源:GB/T 3589020 18,2.63.4转录组高通量测序 tra nscr iptome high-throughput sequencing基于高通量平台,针对细胞内某一功能状态下所能转录出来的所有RNA(主要包括mRNA和非编码RNA),进行平行序列测定的技术,通常一次测序反应能产生不低于100 Mb的测序数据。3.53.63.73.83.9过滤片段cl ea n rea ds指高通量测序rea ds序列过滤后的测测序通量 throughput of gen核昔酸
6、 nuc I eot i de碱基识别质量qua l ity of ba衡量碱基正确识别的概率,通常 的碱基占总碱基的百分比,Q30表示测来源:GB/T 30 98920 14,7.243.10测序读长rea d l ength o构成核酸的基本单位,由 来源:GB/T 30 98920 1测序能测的最长基因片段,来源:GB/T 30 98920 14,单次测序可获得序列信息的 来源:GB/T 30 98920 14,口环值大基eque核糖核酸葭以碱基表示)数量。部分组成质量,Q20表示测序质量值大于20 基的百分比。RNA 完整值(RIN)RNA i ntegr i ty number(RI
7、N)反映RNA完整性的数值。来源:GB/T 40 66420 21,10.113.11接头 a da pter为一段已知的短核甘酸序列,用于链接未知的目标测序片段。2DB53/T 114520 233.12FASTQ 格式 FASTQ forma tFASTQ是基于文本的、保存生物序列(通常是核酸序列)和其测序质量信息的、每四行表示一条序 列的标准格式。来源:GB/T 35890 20 18,2.6,有修改核酸序列对蛋白质序列库比对BLAST X自动将输入的核昔酸序列翻译为氨基酸序列后(根据可能的读码框和编码链的差别,一段核昔酸序-20 冰箱,高压灭菌锅,感量正J0.01 g的电子天平 4.1
8、.2器具一次性手套,一次性采!压灭菌的打孔器(直径1cm)。4.1.3试剂75%乙醇,液氮,三氯/将采集的百合种球或疑似病毒病的N叶片放T的自封袋中,宜4 条件下运输到实验室。采样过程中,应佩戴一次性手套,每采一祷品更换1总套,并用75%乙醇消毒采样工具。4.2.2 百合脱毒种球取样百合脱毒种球抽样方法执行NY/T 1744中5.3.1的规定,抽样数量执行NY/T 402中4.2.1的规定。4.2.3 切花生产用脱毒种球的取样切花生产用脱毒种球抽样方法执行NY/T 1744中5.3.1的规定,抽样数量执行NY/T 402中4.2.1的规4.2.4 百合叶片的取样3DB53/T 114520 2
9、3切花百合的前、中和后期生长过程中,在目测大棚的基础上,采用五点取样法,每点采集疑似病毒 病症状植株4株,分别采集每株中、上部叶,每个部位采集叶片2片。4.3样品处理4.3.1取样时限冷藏运输回实验室的样品应在24 h内完成取样及后续样品处理。4.3.2百合种球样品处理选择未见明显污渍的种球外层鳞片,每个样品称取0.2 g,每10个样品混成一个检测样,用液氮将 检测样研磨成粉末,将粉末装至离心管,液氮速冻,-20 保存备用。4.3.3百合叶片样品处理用打孔器在采集叶片的中部打孔,每个样品称取0.2 g,每10个样品混合成一个检测样,用液氮将 检测样研磨成粉末,将粉末装至离心管,液氮速冻,-20
10、 保存备用。5切花百合病毒种类高通量鉴定和检测方法5.1已报道的切花百合病毒病种类及症状已报道的切花百合病毒种类及症状,参见资料性附录A。5.2转录组高通量测序5.2.1 RNA提取与检测5.2.1.1百合组织总RNA提取称取0.1 g植物组织加液氮研磨成粉末状,迅速将其移入灭菌的1.5 mL或2 0 mL离心管中,加入1 矶的Trizol试剂,剧烈振荡摇匀后室温保持5 min;4,12000 g离心10 min,取上清液,加入 0.2 矶三氯甲烷并剧烈振荡混匀;4,12 000 g离心10 min,取上清液,力口0.6倍体积的异丙醇,颠倒混 匀,室温保持5 min;4,12 000 g离心1
11、0 min,弃上清液,力口75%的乙醇洗涤沉淀,4,7 500 g 离心2 min,弃乙醇;沉淀于室温充分干燥后,溶于30 uL去离子水(DEPC处理),-20 保存备用。也可采用等效的试剂盒提取总RNA。5.2.1.2百合组织总RNA质量要求RNA 总量大于 1 u g;RNA 完整值(RIN)大于 5.8;RNA 纯度要求为 0 0 260/280=1.82.0,0 D260/230 22。5.2.2文库构建和质检5.2.2.1文库构建文库通过01 igo(dT)磁珠富集带有pol yA尾的mRNA。5.2.2.2质量要求4DB53/T 114520 23PCR产物产量2200 ng;PC
12、R产物片段大小为主带(210-250)bp,条带分布(150-500)bp;文库 有效浓度高于8 ngo5.2.3数据处理与质控5.2.3.1数据处理去除带接头(a da pter)的rea ds、去除含N(N表示无法确定碱基信息)的rea ds、去除低质量rea ds。同时对cl ea n da ta进行Q20、Q30和GC含量计算。后续所有分析均是基于cl ea n da ta进行的高质量分析。5.2.3.2数据质控数据质控须符合以下要求:a)单个碱基位置的测序错误率应低于1%,最高不超过6%;b)Q20 90%;Q30 90%;c)测序通量6 Gbo5.2.4转录组拼接及参数设置5.2.
13、4.1转录组拼接高通量测序cl ea n da ta利用Trinity软件进行拼接。5.2.4.2拼接参数min_kmer_cov设置为2,其他参数设置为默认值。测序数据序列输入、输出按GB/T 35890规范执行。具体方法见附录B。5.3序列分析及结果导出5.3.1序列分析参数Bl a stX参数:bl a stx-query references,fa-out resul ts,xl s-db nr-ev a l ue 2e-5-outfmt 6-ma x_ta get_seqs 1;references使用已公布的植物病毒分离物蛋白质数据库。5.3.2序列分析及结果导出平台5.3.2.1
14、园艺作物病毒快速检测与新病毒监测平台http:www.pl a ntv irus,cn/s/dnb/dia mond/cmpr/49o 具体方法及代码见附录 Co5.3.2.2 Vi rusDetecthttp:/bioinfo.bti.Cornel l.edu/tool/VirusDetect/0 具体方法见附录 Do6结果判定对高通量数据生物信息学分析结果进行判定,当“期望”值(E-Va l ue)为“0”时,判定该样品存在 病毒,“命中名称”为所鉴定病毒;当“期望”值(E-Va l ue)无“0”结果时,判定该样品未发现已报道 的切花百合病毒。5DB53/T 114520 23附录 A(
15、资料性)已报道的切花百合病毒种类和症状A.1已报道的切花百合病毒种类查询和统计了侵染切花百合的病毒种类,共有39种病毒侵染切花百合,38种为RNA病毒,1种为DNA 病毒(表A.1)。表A.1侵染切花百合类序号病毒英文名病毒英文名第言台文名、科属1l il y v irus X百合X病藕A IphqflexiviridaePo texvirus2Na rcissus mosa ic v irusNMV林J花叶病辞yAlphaflexiviridaePo texvirus3Pl a nta go a sia tica mosa ic v irusP1AMV车病需Alphaflexiviridae
16、Po texvirus4tul ip v irus XTVX春香X漓*3aflexiviridaePo texvirus5a ppl e stem groov ing v irus&斓毒雪iflexiviridaeCapillovirus6l il y symptoml ess v irusF 百刷皿S 1Be”iflexiviridaeCarlavirus7a ma zon l il y mil d mottl e v irus,1ApMMV亚当磔百氤轻斑驳病室F1toviridaeAnulavirus8cucumber mosa ic v irus5 飞&iv黄瓜花叶病毒oviridaeC
17、ucumovirus9Prunus necrotic ringspot v irus李坏死环斑病毒oviridaeIlarvirus10mil k v etch dwa rf v irus电 紫花英矮缩产毒1 kMoviridaeNanovirus11ca l l a l il y l a tent v irus 2v 1马蹄莲潜隐病毒Ki p房1oviridaePotyvirus12Freesia mosa ic v irus香国飒病用V1 AoviridaePotyvirus13iris potyv irus A&萍莺馆A病君/IftyviridaePotyvirus14iris poty
18、v irus B IPB篁庵B病毒KotyviridaePotyvirus15l il y mottl e v irusLMoVPotyviridaePotyvirus16l il y potyv irus HuN孽HuN病霆vPotyviridaePotyvirus17l il y v irus Alva百合A病毒PotyviridaePotyvirus18l il y v irus YLVY鼓逸JZPotyviridaePotyvirus19l eek yel l ow stripe v irusLYS帮韭球票或病毒J,PotyviridaePotyvirus20rembra ndt tu
19、l ip-brea king v irusRTBV馀勃朗郁金香碎豆病毒PotyviridaePotyvirus21sha l l ot yel l ow stripe v irusSYSV葱黄泰丽毒PotyviridaePotyvirus22Thunberg fritil l a ry mosa ic v irusTFMV浙贝母花叶病毒PotyviridaePotyvirus23tul ip brea king v irusTBV郁金香碎色病毒PotyviridaePotyvirus24turnip mosa ic v irusTuMV芜菁花叶病毒PotyviridaePotyvirus25b
20、roa d bea n wil t v irus 2BBWV2蚕豆萎卷病毒2号SecoviridaeFabavirus26Ara bis mosa ic v irusArMV南芥菜花叶病毒SecoviridaeNepo virus27Cyca s necrotic stunt v irusCNSV苏铁坏死矮化病毒SecoviridaeNepo virus28toba cco ringspot v irusTRSV烟草环斑病毒SecoviridaeNepo virus29toma to ringspot v irusToRSV番茄环斑病毒SecoviridaeNepo virus6DB53/T
21、114520 23表A.1(续)序号病毒英文名病毒英文名缩写病毒中文名科屈30strawberry latent ringspot virusSLRSV草莓潜隐环斑病毒Secoviridae/31carnation mottle virusCarMV麝香石竹斑驳病毒Tombus viridaeAIphacarmovirus32tobacco necrosis virus ATNV-A烟草坏死病毒ATombus viridaeAIphacarmovirus33Capsicum chlorosis orthotospovirusCaCV辣椒褪绿病毒TospoviridaeOrthotospovir
22、us34calla lily chlorotic spot orthotospovirusCCSV点病毒TospoviridaeOrthotospovirus35tomato spotted wilt orthotospovirus_番茄斑萎病毒TospoviridaeOrthotospovirus36tomato zonate spot orthotospovirus番茄环TospoviridaeOrthotospovirus37Hippeastrum chlorotic ringspot orthotospovirus;朱顶热逑环斑病毒,*Tospoviridae/38tobacco ra
23、ttle virus,咽蕈脆裂病毒Kirga viridaeTobra virus39lily virus B17VB/百合B病毒/注:“/”表示目前该病毒暂未归入.目应的科、属。n 三坏死轻斑驳A.2切花百合病毒病症状/绿单一或复合病毒侵染百 出了常见的6类百合病毒病3和植株畸形等症状,图A.1给图A.1常见的6类百合病毒病症状7DB53/T 114520 23附录 B(规范性)转录组高通量测序分析平台鉴定百合病毒方法B.1 转录组拼接B.1.1高通量测序要求高通量测序读长2PE150(双向测序读长150 bp),测序深度26 G。B.1.2 Trinity 参数Trinity-seqTyp
24、e fq-l eft rea ds_l.fq-right rea ds_2.fq-CPU6-ma x_memory 20 G-min_kmer_cov 2。B.1.3 Trinity参数说明Trinity参数说明如下:a)数据通过Trinity软件的无参转录组分析方法进行单独拼接,拼接参数选择“2”;b)-seqType:支持输入数据格式为fq或者fa(图B.1);c)-ma x_memory:内存设置 20 G;d)-l eft-right:如果是双端测序,Teft 为 rea dl,-right 为 rea d2;e)-CPU:软件所用线程 6;-min_kmer_cov 2;f)最小k-
25、mer覆盖值,设置为2去除低丰度数据。图B.1转录组无参拼接获得拼接文件上 cluster all2021/11/23 8:44 Example_cluster_all2021/11/23 8:44 Example_trinity2021/11/23 8:44 Example_unigene2021/11/23 8:44”Trinity2021/11/23 8:44上 unigene2021/11/23 8:448DB53/T 114520 23附录 C(资料性)园艺作物病毒快速检测与新病毒监测平台C.1分析平台的使用输入网址http:www.pl a ntv irus,cn/s/dnb/di
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