ClassⅡb细菌素PlnJK在乳酸乳球菌中的分泌表达和抑菌模式研究.pdf
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1、浙江工商大学硕士学位论文Cl assIIb细菌素P l n JK在乳酸乳球菌中的分泌表达和抑菌模 式研究摘要乳酸菌细菌素是一类在乳酸菌发酵代谢过程中由核糖体产生的 具有抗菌作用的天然蛋白质或多肽类物质,对与产生菌株同源性较近 的菌株具有抑制作用,但产生菌株对其自身产生的细菌素具有免疫 性。乳酸菌细菌素因具有安全、高效、无污染、无抗药性等优点,受 到人们的广泛关注,日益成为许多学者研究的焦点,有望开发成为新 型的绿色食品防腐剂或抗菌药物。目前人们发现的细菌素已超过上百种,但是只有Nisin和其它少数 几种细菌素被允许作为食品添加剂使用。然而Nisin只对革兰氏阳性 菌起作用,这极大地限制了它的应
2、用。与Nisin相比,部分Cl ass II类 的细菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果,其应用潜力 巨大,受到国内外许多研究学者的青睐。本研究对象为Cl assIIb细菌素P l n JK(单肽为P l n J和P l n K)。Cl ass Hb细菌素P l n JK在单肽P l n J和P l n K以等摩尔浓度混合时,其抑菌效果 最强。本研究利用食品级乳酸乳球菌高效表达系统NICE,以分泌型 表达载体P NZ8124分泌表达P l n J和P l n K,并通过一系列分离纯化制备 高纯度的P l n J和P l n K,研究其抑菌活性和抑菌机制,为Cl ass 11b细菌 素P
3、 l n JK在食品及其它领域中的应用提供理论基础。具体研究结果概浙江工商大学硕士学位论文括如下:1、0加J和0加K的基因克隆与表达。根据本实验室分离得到的植 物乳杆菌ZJ316中夕历J和0加K的基因序列,在其序列两端分别添加 EcoR V和TVco I两个酶切位点,构建重组表达质粒pNZ81242历J和 pNZ8124-p历K,并利用电击转化法转化至乳酸乳球菌表达菌株 Lactococcus lactis NZ9 000o 经Nisin诱导后,Tr ic in e-SDSP AGE验证表 明:Nisin能够诱导重组蛋白pNZ8124-P l n J和pNZ8124P l n K的表达。2、重
4、组蛋白pNZ8 124-PlnJ和pNZ8 124PlnK诱导条件优化。从诱 导温度、诱导剂浓度和诱导时间三个方面对重组蛋白在NICE中的诱 导条件进行优化,确定最佳诱导条件为:重组蛋白pNZ8124-P l n J最佳 诱导温度30,Nisin浓度1 n g/mL,诱导时间6 h;重组蛋白 pNZ8124-P l n K最佳诱导温度30,Nisin浓度5 n g/mL,诱导时间6小3、PlnJ和PlnK的分离纯化。根据重组蛋白pNZ8124-P l n J和 pNZ8124-P l n K的特性,确定了一系列的分离纯化方法:(1)利用 XAD-2大孔树脂,对蛋白发酵上清液进行初步纯化,同时收
5、集有活 性的75%甲醇的洗脱液,确定洗脱液中有重组蛋白的存在;(2)利 用SP强阳离子柱,对重组蛋白进一步进行纯化,并通过超滤离心管对 洗脱液脱盐浓缩;(3)利用制备型高效液相色谱(HP LC)对重组蛋 白进行高度纯化,并通过分析型HP LC对分离得到的蛋白P l n J和P l n K 进行纯度分析,得到纯度均在98%以上的蛋白样品。利用BCA法测定 蛋白P l n J和P l n K的浓度,分别为2.215 mg/mL和2.855 mg/mLo4、PlnJ、PlnK和PinJK抑菌活性研究和抑菌机制初探。结果表 浙江工商大学硕士学位论文明细菌素P l n J、P l n K和P l n J
6、K抑菌谱较广,不仅对柠檬色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特菌等革兰氏阳性菌有很好的抑制作用,对沙 门氏菌、副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有较好的抑制效果。细菌素 P l n J、P l n K和P l n JK对沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC),分别为3.212.8和1.6 pMo结果表明P l n JK的抑菌活性明显高于单肽P l n J 或P l n K,说明单肽P l n J和P l n K起协同作用。荧光泄露试验结果表明细 菌素P l n JK的抑菌方式可能是造成靶细胞膜的破裂,使得胞内内容物 流出,最终导致靶细胞的死亡。关键词:P l n JK;NICE异源表达系统;分离纯化;抑菌活性
7、;抑菌机 制m浙江工商大学硕士学位论文SECRETORY EXP RESSION OF Cl ass II b BACTERIOCIN P LNJK IN LACTOCOCCUS LACTIS AND STUDY ON THEANTIBACTERIAL MECHANISMABSTRACTLac tic ac id bac ter ia(LAB)bac ter io c in s ar e r ibo so mal l y syn th esized an timic r o bial peptides o r pr o tein s du r in g f er men tatio n an
8、d metabo l ism o f LAB.Th ey h ave in h ibito r y ef f ec t o n th e str ain with c l o se h o mo l o g y to th e pr o du c e bac ter ia,bu t th e str ain itsel f h as its o wn immu n ity to bac ter io c in s.Lac to bac il l u s bac ter io c in h as been paid mo r e an d mo r e atten tio n bec au se
9、 o f its advan tag es o f saf ety,h ig h ef f ic ien c y,n o po l l u tio n,n o dr u g r esistan c e an d so o n.It is expec ted to be a n ew type o f g r een f o o d pr eser vative o r an tibac ter ial dr u g s.Nisin an d a f ew o th er bac ter io c in s ar e al l o wed to u se as f o o d additive
10、c u r r en tl y in spite o f th e f ac t th at mo r e th an o n e h u n dr ed spec ies o f bac ter io c in h ave been f o u n d o ver th e wo r l d.Ho wever,sin c e Nisin wo r ks o n l y ag ain st g r am-po sitive bac ter ia,th is g r eatl y l imits its appl ic atio n s.Co mpar ed with Nisin,so me C
11、l ass II ar e a kin d o f bac ter io stasis o f Gr am-po sitive bac ter ia an d Gr am-n eg ative bac ter io c in s,an d its appl ic atio n po ten tial is h u g e,wh ic h is f avo r ed by man y sc h o l ar s o ver th e wo r l d.浙江工商大学硕士学位论文Ou r stu dy f o c u sed o n th e Cl ass II b two-peptide bac
12、ter io c in P l n J/K(c o n tain in g two peptides,P l n J an d P l n K).Th e bac ter io static ef f ec t o f P l n JK was str o n g est wh en P l n J an d P l n K wer e mixed in equ imo l ar c o n c en tr atio n.In th is stu dy,th e pl asmid pNZ8124 was sel ec ted as th e sec r eto r y expr essio n
13、 vec to r,an d P l n J an d P l n K wer e sec r eted an d expr essed in n isin-c o n tr o l l ed g en e expr essio n(NICE)system.Th e h ig h pu r ity P l n J an d P l n K wer e pr epar ed by a ser ies o f iso l atio n an d pu r if ic atio n meth o ds,an d th en stu dy th e bac ter io static mec h an
14、 ism,wh ic h pr o vided th e th eo r etic al basis f br th e appl ic atio n o f Cl ass II b bac ter io c in P l n JK in f o o d an d o th er f iel ds.Th e r esu l ts ar e as f o l l o ws:1.Cloning and expression of p加J and plnK.Th e r ec o mbin an t pl asmids pNZ8124-p历J an d pNZ8124-p/n K wer e c o
15、 n str u c ted ac c o r din g to th e sequ en c e o f pin an d plnK f r o m Lactobacillus plantarum ZJ316 o btain ed in o u r l abo r ato r y.EcoR V an d Neo I dig estio n sites wer e added at bo th en ds o f th e sequ en c e,an d tr an sf o r med in to Lactococcus lactis NZ9 000 by el ec tr o po r
16、atio n.Th e expr essio n o f r ec o mbin an t pr o tein s wer e in du c ed by Nisin an d an al ysed by Tr ic in e-SDS-P AGE.2.Optimization of induction conditions of recombinant proteins pNZ8 124-PInJ and pNZ8 124-PlnK.Th e in du c tio n c o n ditio n s o f r ec o mbin an t pr o tein s wer e o ptimi
17、zed f r o m th r ee aspec ts:in du c tio n temper atu r e,in du c er c o n c en tr atio n an d in du c tio n time.Th e o ptimal v浙江工商大学硕士学位论文temper atu r e f br in du c tio n o f r ec o mbin an t pr o tein pNZ8124-P l n J was 30,th e c o n c en tr atio n o f Nisin was 1 n g/mL,an d th e in du c tio
18、n time was 6 h.Th e o ptimal in du c tio n temper atu r e o f th e r ec o mbin an t pr o tein pNZ8124-P l n K was 30,th e c o n c en tr atio n o f Nisin was 5 n g/mL,an d th e in du c tio n time was 6 h.3.Purification of PlnJ and PlnK.A ser ies o f iso l atio n an d pu r if ic atio n meth o ds wer e
19、 establ ish ed ac c o r din g to th e pr o per ties o f th e r ec o mbin an t pr o tein s pNZ8124-P l n J an d pNZ8124-P l n K:(1)Th e pr o tein su per n atan t was extr ac ted by XAD-2 mac r o po r o u s r esin,an d 75%meth an o l ac tive el u ate was c o l l ec ted.(2)Th e r ec o mbin an t pr o te
20、in s was f u r th er pu r if ied by SP str o n g c atio n c o l u mn,an d th e el u en t was desal ted an d c o n c en tr ated by u l tr af il tr atio n c en tr if u g e tu be;(3)Th e r ec o mbin an t pr o tein s was pu r if ied by h ig h r ever e-ph ase HP LC,an d th e pu r if ied P l n J an d P l
21、n K wer e an al yzed by an al ytic al HP LC to o btain pr o tein sampl es with pu r ity abo ve 9 8%.Th e c o n c en tr atio n o f P l n J an d P l n K,measu r ed by BCA P r o tein Assay Kit,was 2.215 mg/mL an d 2.855 mg/mL.4.The Antibacterial activity and antimicrobial mechanism of PlnJ,PlnK and Pln
22、JK.Th e r esu l ts sh o wed th at bac ter io c in P l n J,P l n K an d P l n JK h ad a br o ad spec tr u m o f in h ibito r y ac tivity ag ain st g r am-po sitive bac ter ia su c h as Staphylococcus aureus,Micrococcus luteus an d Listeria monocytogenes,bu t al so h ad a g o o d in h ibito r y ef f e
23、c t o n Salmonella,Vibrio parahaemolyticus an d o th er Gr am-n eg ative VI浙江工商大学硕士学位论文bac ter ia.Th e min imu m in h ibito r y c o n c en tr atio n s(MICs)o f bac ter io c in s P l n J,P l n K an d P l n JK ag ain st Salmonella wer e 3.2|1M,12.8 an d 1.6 piM,r espec tivel y.Th e r esu l t in dic at
24、es th at P l n JK h as str o n g er an timic r o bial ac tivity th an P l n J o r P l n K.Fl u o r esc en t l eak assay in dic ates th at bac ter io c in P l n JK kil l sen sitive bac ter ia by per meabil izin g its membr an e,c au sin g ef f l u x o f in tr ac el l u l ar mater ial ac r o ss th e t
25、r an smembr an e po r e,even tu al l y l eadin g to c el l death.KEYWORDS:P l n JK;NICE h eter o l o g o u s expr essio n system;P u r if ic atio n;An timic r o bial ac tivity;Mo de o f ac tio nvn浙江工商大学硕士学位论文目录第一章绪论.11.1 研究背景.11.2 乳酸菌细菌素.21.2.1 乳酸菌细菌素简介及分类.21.2.2 乳酸菌细菌素的作用机制.41.2.2.1 羊毛硫细菌素的作用机制.41.
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