DB37∕T 3987—2020 兰花细菌性褐腐病菌检疫鉴定方法(山东省).pdf
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1、TCS 65.020.01 B 16 DB37 山东省山巳ET且,万标准DB37/T 3987-2020 兰花细菌性褐腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Erwinia cypr伊dii2020-06-08发布2020-07-08实施山东省市场监督管理局发布目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由青岛海关提出、归口并组织实施。DB37/T 3987-2020 本标准起草单位:青岛海关技术中心、厦门海关技术中心、烟台海关技术中心。本标准主要起草人:厉艳、廖富荣、静平、房呆海、邵秀玲、封立平、李金庆。DB37/T 398
2、7-2020 兰花细菌性褐腐病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了兰花细菌性褐腐病菌的分离培养、生理生化特征及分子生物学等检测鉴定方法。本标准适用于兰花植株中兰花细菌性褐腐病菌的检测鉴定及该病害的田间调查与监测。2 兰花细菌性褐腐病菌基本信息中文名:兰花细菌性褐腐病菌,构兰欧文氏菌学名Erwiniacypl月ipediiChori)Bergey et a1.1923 异名Pectobacteriwllcypripdii ChorD Brenner et a1.1973 Pantoa Cypl月lpdii英文名Bacterialsoft rot of orchid 分类地位:细菌域Bacteria
3、,变形菌门Proteobacteria,变形菌纲Gammaproteobacteria,肠杆菌目Enterobacteriales,肠杆菌科Enterobacteriaceae,欧文民菌属Erwiniao传播途径:远距离传播主要靠带菌种苗,近距离传播主要借助叶面浇水、喷雾或施肥而将病原菌散捂至健康植株上,通过叶片伤口及自然孔口侵染,造成二次感染。3 原理根据兰花细菌性褐腐病菌的特异性DNA序列进行分子生物学检测;根据兰花细菌性褐腐病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症状等对病原菌进行分离培养及致病性测定。4 仪器设备和主要试剂4.1 仪器设备及用具PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、Biol
4、og仪、显做镜、高速冷冻高,心机、恒温培养箱、超净工作台、高压灭菌器、水浴锅、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、做量可调加样器、剪刀、解剖刀、玻璃棒、接种环、慑子、培养皿、酒精灯、三角烧瓶、量筒、离,心管、滤纸等。4.2 主要试剂除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR反应体系用双亲水。商品化试剂参见其使用说明ONA培养基配制方法:蛋白陈10g,牛肉浸膏3g,氯化铀.5g,琼脂17g,调节pH至7.2,用蒸t留水补充至1000 mL,121 oc高压灭菌15mino 5 田间观察检测DB37/T 3987-2020 参照附录A中的症状描述观察植株是否有兰花细菌性
5、褐腐病的典型症状,对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录,并采集表现症状植株送实验室进行检测鉴定,田间无症状植株可随机采样。6 实验室检测6.1 样品制备选择有褐腐症状的植株,用脱脂棉蘸取75%乙醇擦拭病部表面进行表面消毒,用灭菌剪刀剪取新鲜病叶上的病健交界部位(无症状样品,随机选取叶片)组织置于培养皿内,用75%的乙醇(或1%的次氨酸铀)表面消毒50s60 s,无菌水清洗3次,然后将其移至灭菌培养皿中,加适量无菌水,用灭菌玻棒或剪刀捣碎组织,静置15min20 min后,即制成组织悬浮液,用于分离培养及分子生物学检测。6.2 分子生物检测6.2.1 模板制备按照6.1的方法制备成样品悬浮
6、液后,直接用商业化植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明提取样品,总DNA,-20 oc保存备用。对于分离培养得到的疑似菌株,可直接或经裂解处理后(97oc沸水浴10min;12 000 g离心10mi口,取上清液,-20 oc保存)作为分子生物学检测反应模板。6.2.2 常规PCR检测对于叶片等植株样品,以己知带菌的兰花植株组织作阳性对照(若无己知带菌材料,可用模拟带菌方式代替),以健康的兰花植株组织作阴性对照,以双亲水代替模板作为空白对照,对待测样品进行PCRi疑胶电泳检测。对于纯培养菌株,以E.cypripedii标准菌株作阳性对照,用非E.cyprip的:i的植物细菌作阴性对照,以双蒸
7、水代替模板作为空白对照,对待测样品进行PCR疑胶电泳检测,具体检测步骤见附录Bo6.3 分离培养鉴定按照6.1的方法制备成组织悬浮液后,用灭菌接种环蘸取悬浮液在NA培养基上划线分离,28oc恒温培养24h后开始观察,挑耳又可疑单菌落进行纯化,转接2次3次,随后进行致病性测定、BIOLOG鉴定、分子生物学鉴定。6.4 BIOLOG鉴定利用BIOLOG白动微生物鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定,按照说明书进行操作及结果判定。6.5 致病性测定如果有争议或者有必要需按以下步骤对分离纯化的菌株进行致病性测定。将待测菌株在NA培养基上培养24h左右,用无菌水配成10RCFU/mL左右的细菌悬浮液,用针刺
8、法接种至健康兰花茵叶片上28oc 保湿培养,接种48h后开始,每隔24h观察,是否出现附录A中所描述的症状。7 结果判定2 DB37/T 3987-2020 对于有典型症状植株样品,分子生物学检测结果为阳性,即判定为检出兰花细菌性褐腐病菌。无症状植株样品,分子生物学检测结果阳性,且分离培养鉴定或Biolog鉴定为阳性,可判定检出兰花细菌性褐腐病菌。8 样晶及检测结果保存8.1 样品及菌种保存样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出兰花细菌性褐腐病菌的样品应保存于4oc冰箱中,以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。从检测样品中分离并鉴定为兰花细菌性褐腐病菌的菌株,应妥善保存。可采用
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