SC∕T 7229-2019 鲤浮肿病诊断规程.pdf
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1、ICS 65.020.30 B 41:才H中华人民共和国水产行业标准SC/T 7229-2019 鲤浮肿病诊断规程Code of diagnosis for carp edema virus disease(CEVD)2019-08-01发布2019-11-01实施气:?!中华人民共和国农业农村部发布SC/T 7229-2019 本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC、156)归口o本标准起草单位:全国水产技术推广总站、北京市水产技术推广捕。本标准主要起草人:徐立蒲、余卫忠、张文、曹欢、王静坡、王妹、潘勇、张锋、梁胞、王立新、李清。SC/T 7229-2019 鲤浮肿病诊断规程范围本标
2、准站出了鲤浮肿病的缩略语、i式剂和材料、仪器和设备及rI白床症状,规定了采样、核酸检测及综合判定。本i际准适用于鲤浮肿病的流2 规范性引用立件下列文件对于本凡是不注日期的引用GB/丁6682GB/T 18088/111 SC/T 703/水3 缩略i吾4 4.1 4.2水:4.3 7水乙4.4 荧光4.5 套式PCR4.6 环介导等报4.7 Bst酣:-20D(、r-;.,.飞飞且理撞-,4.8 JI物:荧光阳和|肝1吨叫1南部EFJ|吵铲100问1OI/L川民存。4.8.1 荧光PCR 寻|物上游引物qFl:扩-AG下游引物q刷R阳1:5旷队肌A川,丁r门门1丁盯r、探引针-:S-FAM-A
3、GAGTTTGTTTCT丁GCCATACAAACT-BHQl-3;扩增CEVP4a蛋白基因rll76 bp的片段。4.8.2 套式PCR51物4.8.2.1 F1萌rRl扩增CEVP4a蛋向基因巾的548bp片段,F2相R2从i亥片段中再扩增180bp片段。上讲引物Fl:S-GCTGTTGCAACCATTTGAGA-3;下时可|物Rl:5-TGCAGGTTGCTCCT AA TCCT-3;上游引物F2:5-G(、TGCTGCACTTTTAGGAGC主-3:下游号|物R2:i-丁GCAAGTTATTTCGATGCCA-30 4.8.2.2 日F手nBR扩增CEVP4a蛋白基|主l巾的528bp片
4、段,IF和IR从该片段巾再扩增478bp片段。上游引物BF:S-ATGC;AGTATCCAAAGTACTTAG-:3;SC/T 7229-2019 下游引物BR:5-CTCTTCACT A TTGTGACT口头3;上游引物IF:5-GTT ATCAA TGAAA TTTGTGT A TTG-3气下游引物IR:5-TAGCAAAGTACTACCTCATCC-3。4.8.3 LAMP引物F3:TCCCACAGAATGTAATCTCAA;B3:ACCTCATCCAAATTACGTAGT;FIP:GTCTGTCTTCGATAAGACAATGACT-TGTGGAGTTTTTGAAGTATACTGT;BI
5、P:TCAA TCTGAA TTCCTTTCCAGAACA-CGTTGA T ACAA TTCCAGAGC;LF:TGCTCTAGTTCTAGGATTGT;扩增CEVP4a蛋白基因片段。5 仪器和设备5.1 组织研磨器。5.2 高压灭菌锅。5.3 普通冰箱。5.4 超低温冰箱。5.5 低温离心机。5.6 生物安全柜。5.7 荧光PCR仪。5.8 PCR 仪。5.9 可控温水陆锅。6 临床症状发病鱼行动迟缓,有时呈昏睡症状。病鱼的症状包括:烂魄、眼球凹陷、体表靡烂、叶,血、皮下组织水肿、吻端和鳝的基部溃窃等。其中最常见的症状是包括烂跑在内的螺丝损害症状。媳组织在低倍镜观察显示上皮细胞的过度增殖导
6、致媳丝Hl皮支细胞脱落。参见附录A的A.60 7 采样投SC/T7103的规定执行。取样数量按GB/T18088的规定执行。体长4cm的鱼取整条;带卵黄囊的鱼去掉卵黄缉;体长4cm6 cm的鱼苗取鲤、及所有内脏;体长大于6cm的鱼则取跑、肾。8 核酸检测8.1 DNA抽提8.1.1 将样品匀浆后按1:10比例添加PBS缓冲液或细胞培养液,冻融1次.1000 r/min离心10min 后,取450L上清准。加入到1.5 mL的离心管中。8.1.2 加入450LCTAB溶液(见附录B的B.l)混匀。250C处理2h2.5 h。8.1.3 加入600p.L抽提液l(见B.2).混合混匀至少30So
7、12000 r/min离心5min.取上层水相(约8001-)置于新的1.5 mL离心管中。8.1.4 加入700I.lL抽提液2(见B.3).充分混匀至少30So 12000 r/min离心5min.取上层水相(约600L)置于新的1.5 mL离心管中。8.1.5 加人-20.C预冷的1.5倍体积的元水乙醇(约900p.L).ilJ置数次混匀后,一20.C沉淀核酸8h 以上。SC/T 7229一20198.1.6 12 000 r/mn离心30mn.小心弃去上清鞭。干d躁5mn10 min后加11LDEPC水榕解,用作PCR模板。8.1.7 也可采用同等J)J效的核酸抽提试剂盒。8.2 设立
8、对照设立阳性对照、阴性对照和空白对照。取已知含有CEV的阳性样品组织作为阳性对RRp取CEV检测阴性的健康鱼组织作为阴性对照;取等体积的无菌去离子水代替模极作为空白对照。8.3 荧光PCR8.3.1 反应体系2X预?昆合液(2X probe master mix)10L31物qF1和qR1各O.8L、探针0.4L、模板2.5L、加DEPC水至20L。瞬时离心,将PCR管置于荧光PCR仪。8.3.2 反应条件950C 2 mn;950C 5 s、560C31 5,共40个循环。8.3.3 结果判定阴性对照相空白对照应元。值;阳性对照G值35,应进行一次重复检测。若重复检测后结果相同,可判为PCR
9、阳性;否则判为PCR阴性。8.4 套式PCR8.4.1 引物F1/R1和F2/R2分别扩增CEVP4a蛋自基因申548bp和180bp的片段反应体系(50u为2X预棍合被(2X master mix)25L,引物F1、R1各2L,模板5L.DEPC7l补至50L反应条件为950C预变性4min,95(变性1min,550C退火1min,72DC延伸1min,35个循环后720C再延伸10mino如果第一步PCR后的产物在电咏时看不到特异的DNA带,取51J.L产物作模极;如果第一步PCR后的产物在电撞时能看到特异的DNA带,则需将产物按1:100 1:1 000稀释,取5L稀释后产物作模板,反
10、应条件同上,加入引物F2、R2进行套式PCR扩增。8.4.2 引物BF/BR和IF/IR分别扩增CEVP4a蛋白基因中528bp和478bp的片段反应体系(50L)为2X预混合液(2X master mix)25L,引物BF、BR各2L,模板5L,DEPC7l补至50L。反应条件为95(预变性4mn,950C变性1min,45DC退火1min,720C延伸1min,35个循环后720C再延伸10mno如果第一步PCR后的产物在电泳时看不到特异的DNA带,取5L产物作模极;如果第一步PCR后的产物在电泳时能看到特异的DNA带,则需将产物按1:1 00 1:1 000稀释,取5L稀释后产物作模板,
11、反应条件同上,加入引物IF、IR进行套式PCR扩增。8.4.3 琼脂糖电谏用lX电旅缓冲液(见B.4)配制2%的琼脂糖凝胶(含0.5g/mLEB,见B.5,或其他等效商品化i式剂)。将5L样品和1L6X上样缓冲液(见B.6)混匀后加入样品孔,在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5V/cm电泳约0.5h.当澳酣蓝到达底部时停止,将凝胶置于凝股成像仪上观察。8.4.4 测序取PCR产物进行基因序列测定,将测序结果与GenBank中参考序列(见附录。进行同源性比对。8.4.5 结果判定PCR扩增后,阳性对照会出现特异的DNA带,阴性对照和空白对照均没有该条带,反应成立。待测样品第一步PCR扩增有特异
12、的DNA带(548bp或528b肘,或第二步PCR扩增后有特异的DNA带080bp或478bp),并经基因测序确定是CEV的,可判为PCR阳性;未扩增出条带的,或条带大小与特异的DNA带大小不一致,或经基因测序确定不是CEV的,判为PCR阴性。8.5 LAMP检测8.5.1 反应体系LA岛1p2X反应缓冲破(含dNTP)12.5L.8 U Bst DNA polymerase 1L.钙黄绿素CFD)1L(包含有SCjT 7229-2019 0.5 mmol/L钙黄绿素和10mmol/L MnCb),FIP 0.4件,BIP 0.4L,F30.1L,B3 O.1L,LF o.2L,模极2件,DE
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