SC∕T 7231-2019 贝类折光马尔太虫病诊断规程.pdf
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1、ICS 65.020.30 50:才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7231-2019 贝类折光马尔太虫病诊断规程Code of diagnosis for marteiliosis of mol1usks 2019-08-01发布2019-11-01实施中华人民共和国农业农村部发布SC/T 7231-2019 日U昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业农村部植业随政管理局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所
2、、全国水产技术推广总站、深圳海关。本标准主要起草人:白昌明、杨冰、温智清、王崇明、黄倍、李清、万晓援、史成银、李晨、辛鲁生、余卫忠。SC/T 7231-2019 贝类折光马尔太虫病诊断规程1 范围本标准给出了贝类折光马尔太虫病(marteiliosis)诊断所需试剂和材料、器材和设备,规定了采样、PCR检测和l综合判定的要求c本标准适用于贝类样品中折光马尔太虫(Mrleiliar旷rl1lgel1:、)感染的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改
3、单)适用于本文件。SC/T 7205.1 牡蜘包纳米虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法SC/T 7207.1 牡蜗马尔太虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法SC/T 7207.2 牡师马尔太虫病诊断规程第2部分:组织病理学珍断法SC/T 7207.3 牡师马尔太虫病诊断规程第3部分:透射电镜险断法3 缩略语下列缩略i吾适用于本文件。bp:碱基对(basepair)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTP曰:脱氧核糖核背三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)EB:澳化乙I!走(ethidiumbromide)E
4、DTA:乙二脏四乙酸Cetl巾nediaminetetraaceticacid)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechain reaction)SDS:十二烧基硫酸(sodiumdodecyl sufate)Taq:水生栖热菌(Thermusqual icus)TE:Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTATris HC)Tris:三控甲基氨基甲皖(trishydroxymethyl aminomethane)4 试剂和材料4.1 除非另有说明,标准rl=1使用的水为蒸饱水、去离子水或相当纯度的水。4.2 元水乙醇:分析纯。4.3 TE缓冲液的配制按附录A1二l:tA.1的规定执行。4
5、.4 抽提缓冲液的配制按附录A.2的规定执行。4.5 蛋白酶K的配1lilJ按附录A.3的规定执行。4.6 10 mol/L乙酸锁的配制按附录A.4的规定执行。4.7 Tirs饱和酣(pH注7.8):分析纯。4.8 酣/氯仿/异戊醇(25:24:1):分析纯。4.9 氯仿/异戊醇(24:1):分析纯。4.10 1 X电泳缓冲液的配制l按附录A.5的规定执行。4.11 70%乙醉的配制按附录A.6的规定执行。SC/T 7231-2019 4.12 dNTP(各2.5 mmol/L):生化试剂,含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的棍合物,一200C保存,用于PCR。4.1
6、3 10XPCR缓冲液:生化试剂,无Mg2-离子,1植TqDNA聚合酶提供.-200C保存。4.14 MgC12(25 mmol/U:生化试剂,-200C保存。4.15 Tq DNA聚合酶(5U/L):生化试剂,-20oC保存。4.16 正向引物Pr4C10)lmol/U:5-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3,-20oC保存。4.17 反向引物Pr5(10mol/U:5仁CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-扩,200C保存。4.18 阳性对照:己知|受折光马尔太虫感毕陶最强蝇辑样品也70oC保存。4.19 阴性对照:己知未受折光旦尔爱虫感挚的贝樊组凯样
7、品,三保存。4.20 PCR检测空白对4.21 琼脂糖。4.22 DNA分4.23 10 mg/mL nu 咱|叫/古JA4Fhu户。7nOQdl民dFhdphdphdhdFhdhdEUEJRUFhJ6 采样6.1 采样对象牡师等易感双壳6.2 采样数量、方法和保应符合SC/T7205.1 6.3 样品的采集稚贝(附着后至2mm)和幼贝(2mm3 cm)取内脏团;成贝(3cm)取胃、肠道、消化腺幸1闭壳肌。样品采集后分别置于1.5 mL离心管中,立即进行DNA提取操作或暂时保存于一200C的冰箱中。7 PCR检测7.1 DNA的提取7.1.1 取30mg50 mg组织样品,加人抽提缓冲液500
8、L.充分研靡,3 7C温浴1h。提取过程同时设置阳性对照、阴性对照。7.1.2 加人2.5L 20 mg/mL蛋白酶K,至终被度100g/mL.棍匀后置于500C水浴3h,不时旋动。7.1.3 将济被冷却至室温,加入等体积平衡盼,颠倒泪合10min.于10000 r/min离心3min分离两相。7.1.4 水相移至新的1.5 mL离心管中,加入等体积酣/氯仿/异戊醉(25:24:1),颠倒混合10min,于SC/T 7231-2019 10000 r/min离心1min分离两相。7.1.5 水相移至一新的1.5 mL离心管中,加人等体积氯仿/异戊醇(24:1),颠倒棍合10min,于10000
9、r/min离心1min分离两相。7.1.6 水相移至一新的1.5 mL离心管中,加入100L 10 mol/L乙酸锁,由匀后,再加人2倍体积预冷元水乙醇(-200C)泪匀,一200C放置2ho 10 000 r/min离心10min.弃上清液。7.1.7 用70%乙醇洗深沉淀2次,每次10000 r/min离心5min,倾去上清液,沉淀于室温晾干。7.1.8 加入100L灭菌双蒸水济解DNA。7.1.9 若DNA样品需要保存,可熔解于100LTE缓冲液中并保存于一200C的冰箱中。7.1.10 可以采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA抽提试剂盒。7.2 PCR扩增7.2.1 PCR反应
10、体系:按照表l的要求,加入除了qDNA聚合酶以外的各项试剂,配制成大体积的预混物,分装保存于一200C的冰箱中。11伍用前,加入相应体积的T叫DNA聚合酶,棍匀,按l个反应体系/支分装到0.2mL PCR管中。分别加入各样品的模板DNA(浓度:50 ng;.tl,100 ng/U1L,同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。表1PCR反应预混物所需试剂和组成i式弃。2 5L1本系试剂终浓度10X PCR缓rl夜2.5L 1 X PCR缓冲液MgCIz(25 mmol/U 2.5L 2.5 mmol/L dNTPs(各2.5mmol/U 2.0 L 200mol汀,引物Pr4(10mol/Ll 1.
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