DB43∕T 1824-2020 蔬菜作物辣椒褪绿病毒检测技术规程(湖南省).pdf
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1、ICS 65.020 816 湖南省地DB43 万标准DB43/T 1824-2020 蔬菜作物辣椒褪绿病毒检测技术规程Technical Regulation for Detection of Capsicum chlorosis orthotospovirus in Vegetables 2020-08-25发布2020-11-25实施沽用薛Z毛旨芮王土w且主李雪辛苦王里走司发布DB43/T 1824-2020 目次前言.III I 范围.2 圳范性才|用文件. 3 术语和;主义3.1 辣椒褪绿病毒. 3. 2 反转录聚合酶链式反应.1 3. 3 双抗体夹心酶联免疫吸附法3. 4 阳性对照
2、13. .5 阴性对照.1 3. 6 空白对照.1 4 仪器和耗材. 2 5 样品要求.2 .5. 1 样品采集.2 .5. 2 样品处理.2 6 检测方法.2 6.1 反转录一聚合酶链式反应CRT-PCR)检测方法.2 6. 2 双抗体夹心酶联免疫败附法(DAS-ELISA)检测方法.3 7 检测结果判定.3 附录A(规范性附录)反转录聚合酶链式反应(盯PCR)检测方法.5 附录B(规范性附录)双抗体夹心酶联免疫吸附法。AS-ELISA)检测方法.9 I DB43/T 1824-2020 目IJ1=1 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容nJ能涉及专利。
3、本文件的发布机构不屈担识别这些专利的责任。本标准由湖南省农业农村厅提出O本标准向湖南省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:湖南省植物保护研究所、湖南省蔬菜研究所、|临津县农技推广中心、保靖县农业农村用、新化县植保植检站、东北农业大学、益阳市资阳区植保植检站、津市市植保植检站、桃源县植保植检站。本标准主要起草人:孙书娥、张德咏、刘勇、张战池、刘杜平、王俊华、程晓非、廖基常、张益夫、马家湘、裴色、朱春H军、成飞雪、程菊娥、谭新球、张卓、张松柏、史晓斌。III DB43/T 1824-2020 蔬菜作物辣椒褪绿病毒检测技术规程1 范围本标准规定了蔬菜作物辣椒褪绿病毒(Crpsicumchlor
4、osis orthotospovirus, CaCV)检测技术规程的术语和定义、仪器和耗材、样品要求、检测方法、检测结果及结果判定等内容。本标准适用I蔬菜作物辣椒褪绿病毒的检测和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文刊,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义|、伞列术语和定义适用于本标准O3. 1 辣椒褪绿病毒Capsicum chlorosis orthotospovirus, CaCV 该病毒是什j尼亚病毒科(Bunyavirida
5、e)Orthotospovirus病毒屑的一个暂定种。在番茄wl片上可引起芽坏死,果实七引起坏死环斑;辣椒叶片七可引起褪绿、坏死环斑,顶端材、死,叶片畸形;西葫芦叶片上可引起花叶、畸形,果实上引起褪绿、间内不可L3. 2 反转录-聚合酶链式反应Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR 在反转录酶作用下将mRNA反转录成cDNA,再利用PCR以cDNA为模板,扩I曾合成同的片段的方法。3. 3 双抗体夹心酶联免疫眼附法Double Antihody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent As
6、say, DAS-ELISA 先将待检测样品进行提取后,加入已被CaCV抗体包被的做孔板进行免疫反应,然后通过与酶标抗体结合,最后通过是杳与底物反应跟包判定是再存在相关病毒以及病毒浓度的一种血清学检测方法。3. 4 日性对照Positive Control 凡是确定可以出现预期结果的处理,称为阳性对照。3. 5 阴性对照Negative Control 凡是确定不会出现预期结果的处理,称为阴性对照。3. 6 空白对照Blank Control 凡是不加处理因素的处理,称为空白对照。D843/T 1824-2020 4 仪器和耗材台式离心机、水浴锅、制冰机、超净工作台、PCR仪、酶标仪、培养箱、
7、冰箱、灭菌锅、电子天平、微波炉、DYY-6C水平电泳槽、服胶成像系统、移液器、枪头、离心管、组织研磨仪、研钵、研棒、一次性PE手套、PCR管、记弓笔、采样袋等。5 样品要求5. 1 样品采集佩戴一次性PE于套采集典型发病部位样品,置j二采样袋中,标记样品种类、症状、地点、时间、采样人等信息,进行编号。采集不同植株需更才兔子套。5. 2 样品处理常温下保存不超过24h,冷藏不超过2-3d,需要较长时间保存的,)1节液氮速冻后,-80oC保存。6 检测方法在以下的两种方法中,均市设置阳性对照、|坷性对照和空白对照。阳性样品为己鉴定被CaCV侵染的植物材料,阴性样品J-J健康的同种植物材料,空白对照
8、为无菌水。6. 1 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法6. 1. 1 植物总RNA的捏取采用改进的硅粒吸附法。具体方法见附录A3。也可采用其他RNA提取试剂盒进行,操作步骤参照相应试剂盒说明书。6.1.2 RT-PCR 设计用于RT-PCR的引物,引物序列为:上游引物CaCV-F:ACTTTCCATCAACCTCTGT,下游引物CaCV-R:GTTATGGCCATATTTCCCTo 以提取的RNA为模板用于cDNA的合成,以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。具体方法见附录A4。6. 1.3 扩增产物检测将5LPCR扩增产物进行凝胶电泳检测,根据DNA分于量标记判断扩蹭出的同的条带
9、大小,观察并记录DNA条带有7己和条带大小。具体方法见附录A40 6.1.4 结果记录对电泳结果进行记录、拍照。见附录A60 6. 1.5 结果判定RT-PCR扩增产物大小为812bpo阳性对照有目标条带而阴性对照和空白对照尤目标条带时,检测结果有效。钊测样品在810bp左右山现核酸条带,表明样品为阳性,无目标条带则为阴性。2 DB43/T 1824-2020 6. 2 双抗体夹心酶联免疫眼附法(DAS-ELISA)检测万法6.2. 1 样品准备称植物组织o.51. 0 g放入2mL离心管巾,才去重量体和比1: 10 (g/mL)加入0.01mol/L样品研磨缓冲液,磨碎至明显组织消失。离心后
10、以上清备用,或短时间内rc保存备用。具体方法见附录B2。6. 2. 2 包被用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白IgG至最适浓度进行包被。6. 2. 3 孵盲4Cli夜或3TC温育24h。6. 2. 4洗j条用PBST缓冲液洗孔3次,每次洗孔之间至少问|俑5mino 6. 2. 5 待坝。样品孵盲每凹孔加入200Jl L检测样品,3TC泪育24h。6. 2. 6 洗涤同6.2.4。6. 2. 7 酶标抗体孵盲每凹孔加入200Jl L用稀释缓冲液稀释后的酶标特异性抗体溶液,37C温育24ho 6. 2. 8 洗涤同6.2.406. 2. 9 显色弃洗脱液,加入200L、日色液,室温下温育,待阳性对照
11、号色明日,而阴性没有任何血色时终止反应。i己录结果并照相保存。6.2.10 结果记录对结果进行记录、拍照。见附录B40 6. 2. 11 结果判定阳性别照显示黄色而阴性别照未显包时,检测结果有效。显示黄包的待测样品判定为阳性,未显色的待测样品判定为阴性。7 检测结果判定根据附录A7判定检测结束。检测结果为阳性,即判定该样品含有CaCV;检测结果为阴性,则判定该样品不含有CaCV。3 D843/T 1824-2020 根据附录B5判定检测结果。检测结果为阳性,1.11判定该样品含有CaCV;检测结果为阴性,则判定该样品不含有CaCVo4 DB43/T 1824-2020 附录A(规范性附录)反转
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