GB 15193.23-2014 食品安全国家标准 体外哺乳细胞染色体畸变试验.pdf
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1、书书书中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准犌 犅 食品安全国家标准体外哺乳类细胞染色体畸变试验( 报批稿) 发布 实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布书书书食品安全国家标准体外哺乳类细胞染色体畸变试验范围本标准规定了体外哺乳类细胞染色体畸变试验的基本试验方法和技术要求。本标准适用于评价受试物的体外哺乳类细胞染色体畸变。术语和定义染色体结构畸变通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体结构变化。如染色体中间缺失和断片、 染色体互换等。染色体结构畸变可分为染色体型畸变( ) 和染色单体型畸变( ) 。染色体型畸变染色体结构损伤, 表现为在两个染色单体的相同位点均出现
2、断裂或断裂重组等改变。染色单体型畸变染色体结构损伤, 表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组等改变。有丝分裂指数中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值; 是反映细胞增殖程度的指标。核内复制在 复制的期之后, 细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个期的过程。其结果是染色体有、 倍的染色单体。裂隙染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度, 为染色单体的最小错误排列。试验目的和原理通过检测受试物是否诱发体外培养的哺乳类细胞染色体畸变, 评价受试物致突变的可能性。在加入或不加入代谢活化系统的条件下, 使培养的哺乳类细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂( 如秋水仙素或秋水仙胺) 处理, 使细胞停止在中
3、期分裂相, 随后收获细胞、 制片、 染色、 分析染色体畸变。仪器和试剂仪器细胞培养箱, 倒置显微镜, 超净台, 离心机。犌 犅 培养液常用 培养液( ,) , 也可选用其他合适培养液。加入抗菌素( 青霉素按 、 链霉素 ) , 将灭活的胎牛血清或小牛血清按 的比例加入培养液。代谢活化系统犛 辅助因子的配制镁钾溶液氯化镁和氯化钾 加蒸馏水溶解至 。犿 狅 犾犔磷酸盐缓冲液(狆 犎)磷酸氢二钠( , ) , 磷酸二氢钠( , ) , 调 至, 灭菌或滤菌。辅酶 ( 氧化型) 溶液无菌条件下称取辅酶 , 用无菌蒸馏水溶解配制成 溶液, 现用现配。葡萄糖 磷酸钠盐溶液称取葡萄糖 磷酸钠盐, 用蒸馏水溶
4、解配制成 , 过滤灭菌。现用现配。大鼠肝犛 组分的诱导和配制选健康雄 性 成 年 或 大 鼠, 体 重 , 约周 龄周 龄。将 多 氯 联 苯( ) 溶于玉米油中, 浓度为 , 按 体重无菌操作一次腹腔注射,后处死动物, 处死前禁食 。也可采用苯巴比妥钠和萘黄酮联合诱导的方法进行制备, 经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和萘黄酮, 剂量均为 体重, 连续, 禁食 后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。处死动物后取出肝脏, 称重后用新鲜冰冷的 氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次, 以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝( 湿重) 加 氯化钾溶液 , 连同烧杯移入冰浴中, 用消毒剪刀剪碎肝脏, 在玻璃匀浆
5、器( 低于 , ) 或组织匀浆器( 低于 , )中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。将制成的肝匀浆在低温() 高速离心机上以 犵离心 , 吸出上清液为 组分,分装于无菌冷冻管中, 每管 左右, 最好用液氮或干冰速冻后置 低温保存。 组分制成后, 经无菌检查, 测定蛋白含量( 法) , 每毫升蛋白含量不超过 为宜, 并经间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于 低温或冰冻干燥, 保存期不超过年。 犛 混合液的制备一般由 组分和辅助因子按组成 的 混合液, 无菌现用现配。 混合液 配制如下:取上述磷酸盐缓冲液 、 镁钾溶液 、 葡萄糖 磷酸钠盐溶液 、 辅酶 溶液 、肝 组分 , 混匀,
6、置冰浴中待用。 混合液浓度一般为 , 实际使用浓度可由各实验室自行决定, 但需对其活性进行鉴定,犌 犅 必须能明显活化阳性对照物, 且对细胞无明显毒性。秋水仙素溶液用 溶液配制适当浓度的储备液, 过滤除菌, 在避光冷藏的条件下至少能保存个月。 犿 狅 犾犔氯化钾溶液 氯化钾加蒸馏水至 。固定液甲醇冰醋酸为, 临用前配制。根据试验条件, 可适当调整冰醋酸的浓度, 改善染色体分散度, 但不宜过大, 导致细胞破裂。姬姆萨(犌 犻 犲 犿 狊 犪) 染液取姬姆萨染料, 置乳钵中, 加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至 , 待完全溶解后, 再加 甘油, 放入 温箱中保温 。保温期间振摇数次, 使充分溶解。取出过
7、滤,周后使用, 作为姬姆萨染液原液。使用时, 取份姬姆萨染液原液, 与份 磷酸盐缓冲液( ) 混合,配成其应用液, 现配现用。磷酸盐缓冲液( , ) 配制方法如下:)第一液: 取磷酸氢二钠( ) 溶于去离子水 中, 配成 溶液;)第二液: 取磷酸二氢钾( ) 溶于去离子水 中, 配成 溶液;)取第一液 加于第二液 中混匀, 即为 的 磷酸盐缓冲液。试验方法受试物固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶媒中, 并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度。受试物应无菌现用现配, 否则须确认储存不影响其稳定性。细胞株可选用中国仓鼠肺() 细胞株或卵巢() 细胞株、 人或其他哺乳动物外周血淋巴细胞
8、( ) 。试验前检查细胞的核型和染色体数目, 检测细胞有无支原体污染。推荐使用中国仓鼠肺() 细胞株。剂量剂量设置受试物至少应取个检测剂量。对有细胞毒性的受试物, 其剂量范围应包括从最大毒性至几乎无毒性( 细胞存活率在 的范围内) ; 通常浓度间隔系数不大于槡 。最高剂量的选择当收获细胞时, 最高剂量应能明显减少细胞计数或有丝分裂指数( 大于 , 如毒性过大, 应适当增加接种细胞数) ; 同时应该考虑受试物对溶解度、 和摩尔渗透压浓度的影响; 对无细胞毒性或细胞毒性很小的化合物, 最高剂量应达到、 或 。犌 犅 对溶解度较低的物质, 当达到最大溶解浓度时仍无毒性, 则最高剂量应是在最终培养液中
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