GB∕T 40392-2021 循环冷却水中军团菌的检测.pdf
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1、ICS 13.060.70; 13.060.25CCS G 76中华人民共和国国家标准GB/T 403922021循环冷却水中军团菌的检测Detection of Legionella in circulating cooling water(ISO 11731 :2017, Water qualityEnumeration of Legionella ,NEQ)2021-08-20 发布2022-03-01 实施国家市场监督管理总局分布 国家标准化管理委员会发布GB/T 403922021-T Z - 1刖 百本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草
2、规则的规定 起草。本文件参考ISO 1173L2017水质军团菌的计数起草,一致性程度为非等效。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国石油和化学工业联合会提出。本文件由全国化学标准化技术委员会水处理剂分技术委员会(SAC/TC 63/SC 5)归口。本文件起草单位:石家庄给源环保科技有限公司、江苏省特种设备安全监督检验研究院常州分院、 华测检测认证集团股份有限公司、中海油天津化工研究设计院有限公司、石家庄市疾病预防控制中心、 同济大学、天津市疾病预防控制中心、浙江水知音检测有限公司、鞍钢贝克吉利尼水处理有限公司。本文件主要起草人:李永广、孙小伟、
3、刘文秋、滕厚开、李丽婕、王妍、李风亭、林肖惠、俞明华、孙辉、 刘娇娇。IGB/T 403922021循环冷却水中军团菌的检测警告:军团菌是致病菌,使用本文件的人员应有二级生物安全防护实验室工作的实践经验。本文件 并未指出所有可能的安全问题,使用者有责任在处理或检测可疑致病菌时采取适当的预防措施,减少职 业暴露,并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本文件规定了循环冷却水中军团菌的检测方法。本文件适用于循环冷却水中军团菌的检测,也适用于原水、生活用水、其他工业用水及废水中军团 菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅
4、该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。GB/T 668 22008分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T 27405实验室质量控制规范食品微生物检测3术语和定义GB/T 27405界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1军团菌 Legionella一类革兰氏阴性杆菌的总称,两端钝圆,有鞭毛,无芽泡和荚膜,具有在含有L-半胱氨酸和三价铁 盐缓冲液的活性炭-酵母提取液(BCYE)培养基上生长的特性。来源:ISO 11731:2017,3.口3.2嗜肺军团菌 Legionella pn
5、eumophila ;Lp经生化试验和血清学试验鉴定确认的一种具有致病性的军团菌,是引起军团菌病的主要菌型。4通则本文件规定的检测应符合GB/T 27403并应在二级生物安全防护实验室(BSL-2)内完成,检出军团 菌的样品及培养基应经过无害化处理。1GB/T 4039220215 原理循环冷却水中军团菌数目一般达不到直接涂布检测的数目(10、CFU/L),应通过膜过滤浓缩水样 中的细菌,并对浓缩的菌液进行酸处理或热处理,以减少杂菌对军团菌生长的抑制作用。将处理后的菌 液接种到对军团菌具有选择性的GVPC培养基上,经培养生成典型菌落。利用军团菌在活性炭-酵母 提取液培养基(BCYE培养基)生长
6、而在L-半胱氨酸缺失的BCYE培养基(BCYE-Cys培养基)不生长 的特性,鉴定GVPC培养基上培养出的菌落是否为军团菌,同时用平皿计数法进行计数。在军团菌疾 病暴发时或有疑似病例时进一步经生化试验和血清学试验鉴定嗜肺军团菌。6试剂或材料除非另有规定,仅使用分析纯试剂。6.1 无菌水:应符合GB/T 668 22008中三级水的规定,于121 士 1 高压蒸汽灭菌20 min。6.2 硫代硫酸钠:使用前应灭菌。6.3 活性炭-酵母提取液培养基(BCYE培养基):按附录A中A.1制备或采用市售成品。6.4 L-半胱氨酸缺失的BCYE培养基(BCYE-Cys培养基):按A.2制备或采用市售成品。
7、6.5 选择性培养基(GVPC培养基):按A.3制备或采用市售成品。6.6 酸缓冲液:按A.4制备。7仪器设备7.1 离心机:转速为0 r/min8 000 r/min。配有300 mL500 mL具螺旋盖的离心瓶。7.2 真空泵。7.3 超声波振荡器或涡旋混合器。7.4 无菌涂布器。7.5 CO?培养箱:36 士1 。7.6 普通光学显微镜或荧光显微镜。7.7 紫外线灯:波长为360 nm + 20 nmo7.8 无菌接种环:直径为3 mm。7.9 无菌平皿:直径为90 mm。7.10 无菌镜子。7.11 微量移液器:100 ML,200 mL07.12 无菌微孔滤膜:直径为47 mm50
8、mm,孔径为0.22日m或0.45日m。8样品采集8.1 用无菌玻璃、聚乙烯或类似容器收集水样200 mL1 000 mL,记录样品的来源、体积和取样时间。 应在循环冷却水系统投加杀菌剂之前采集样品。如果水样含有氧化型杀菌剂,应在采样前于无菌操作 条件下,加入灭过菌的硫代硫酸钠,使每升样品含硫代硫酸钠约0go8.2 样品采集后应立即送回实验室进行检测,运输时应避免光照和受热。当天不能进行检测时,应在 2 8 的冷藏条件下存储或运输,最好在2 d内检测,最长不应超过14 d。2GB/T 4039220219试验步骤9.1 样品预处理9.1.1 杂质去除水样中含有杂质时可静置沉淀或1 000 r/
9、min离心1 min,取上清液备用。9.1.2 浓缩在真空过滤系统上安装微孔滤膜,取水样上清液200 mL-l 000 mL过滤,记录过滤水样的体积 Vlolo过滤后取下滤膜,置于带盖的无菌容器中,用无菌剪刀剪碎,力口 15.0 mL无菌水,放入涡旋混合器 振荡至少2 min(也可将容器放入超声波振荡器中振荡2 min10 min,稀释液液面应低于超声波振荡 器水面)充分洗脱,作为浓缩液备用,记录体积Ko当样品中军团菌的菌落数量超过IO, CFU/L时,可不进行样品浓缩处理,计数时按直接涂布法 计数。9.2 样品制备9.2.1 将9.1.2的浓缩液(无需浓缩时取原液)分成三份。其中一份不做处理
10、,另两份分别采用热处理 和酸处理方式处理。9.2.2 热处理:移取1.0 mL浓缩液(或原液)于一无菌容器中,置于50 士1 的水浴中加热30 min。 9.2.3酸处理:移取3.0 mL浓缩液(或原液)于一无菌容器中,加入3.0 mL酸缓冲液摇匀,其pH值约 为2.2 ,放置5 min。9.3 接种取三个无菌GVPC培养基平皿。分别取未经处理、热处理、酸处理样品各0.1 mL,用无菌涂布器将 接种液均匀涂布于相对应的GVPC培养基平皿的整个表面。9.4 培养将已接种的平板倒置放入CO?培养箱中,调节CO?浓度为2.5%,温度为36。士1 ,相对湿度不 小于95%,培养10 d。9.5 检查平
11、板培养期间,在第三天开始检查培养皿,并在培养期结束时进行最终检查,记录可疑军团菌菌落的数 量。在平板上生长小于300个菌落为宜,如有大量军团菌生长,则应减少过滤样品的体积或稀释浓缩 液。军团菌的生长可能被其他菌掩盖或抑制,如果怀疑军团菌被抑制应重新处理水样进行培养。典型的军团菌菌落通常呈白色、灰色、蓝色或紫色,也可能出现棕色、灰绿色、深红色。菌落表面光 滑,边缘整齐,呈典型毛玻璃状。在紫外光下有荧光,荧光的颜色有助于区分样品中军团菌的不同种类。 为了避免军团菌的死亡,不能将平板长时间暴露在紫外灯下,宜在数秒内完成。9.6 菌落验证在GVPC培养基上2 d内生长的菌落均不是军团菌。从GVPC培养
12、基上选择3 d10 d内生长的 疑似军团菌菌落分别接种到BCYE和BCYE-Cys两块培养基上进行培养。如果有不同类型的疑似军 团菌菌落,则每种类型应至少选择两个疑似菌落,总共至少选择五个疑似菌落(五个以下全选)进行培养 3GB/T 403922021验证。将疑似菌落在含2.5%CO2的培养箱中36 1 培养2 d。凡在BCYE上生长而在BCYE-Cys 上不生长的被确认为军团菌菌落,记录每个平板的结果。如需计数时,计算确认的军团菌菌落数Ni占从培养基上挑取的疑似军团菌菌落数量N的比例。9.7 嗜肺军团菌的鉴定在常规监测中可不进行嗜肺军团菌的鉴定,在军团菌疾病暴发时或有疑似病例时应进行嗜肺军团
13、 菌的鉴定。取BCYE培养基上经确证的军团菌菌落按附录B进行鉴定。10军团菌的计数10.1 直接涂布法水样中军团菌的计数以每升样品中的菌落数X计,单位为菌落形成单位每升(CFU/L),按公 式(1)计算:a . WX = - X 1 000 .( 1 )式中:a GVPC培养基上疑似军团菌的菌落数,单位为菌落形成单位(CFU);Ni确认的军团菌菌落数,单位为菌落形成单位(CFU);N 培养基上挑取的疑似军团菌菌落数,单位为菌落形成单位(CFU);V -一接种的原液的体积的数值,单位为毫升(mL)(原液、热处理样品:V = 0.1;酸处理样品:V = 0.05) o10.2 浓缩法水样中军团菌的
14、计数以每升样品中的菌落数X计,单位为菌落形成单位每升(CFU/L),按公 式(2)计算:(2 - NX =-XI 000 .( 2 )V V tot式中:a GVPC培养基上疑似军团菌的菌落数,单位为菌落形成单位(CFU);N1确认的军团菌菌落数,单位为菌落形成单位(CFU);N 培养基上挑取的疑似军团菌菌落数,单位为菌落形成单位(CFU);Vc量取的无菌水的体积的数值,单位为毫升(mL)(V0 = 15.0);V 一接种的浓缩液的体积的数值,单位为毫升(mL)(未经处理的浓缩液样品、热处理样品V = 0.1;酸处理样品V=0.05);Vtot 过滤水样的体积的数值,单位为毫升(mL)。10.
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